目的:慢性心力衰竭(CHF)是众多心脏疾病的终末期,现有治疗手段患者预后差,且5年内的死亡率高。心宝丸是一个中药复方制剂,临床上常用于治疗心功能不全、缺血性心脏病引起的心绞痛等心血管疾病,疗效确切。我们预实验发现心宝丸可显著提高慢性心衰大鼠心功能,但作用机制尚不明确。慢性心衰发病机制复杂多样,主要机制是交感神经系统长期激活导致信号传导紊乱、心肌损伤、最终发生心室重构。β2肾上腺素受体(β2AR)是心脏中表达较多的G蛋白偶联受体之一,具有增加心率和收缩力、传导心脏信号的作用。心衰时,会出现β2AR脱敏和数量减少,而泛素化降解是β2AR减少的原因之一,其泛素化过程需要三种E1、E2、E3泛素酶参与,其中E3泛素连接酶是关键限速酶。MDM2作为一种E3泛素连接酶,其能够调控βarrestin2的泛素化,招募Nedd4泛素连接酶,从而介导β2AR的泛素化和溶酶体靶向降解。因此,我们提出“心宝丸可通过调控MDM2/βarrestin2/Nedd4介导β2AR泛素化而发挥抗CHF作用”的科学假说。为此,本论文拟采用左前降支冠状动脉结扎造慢性心衰动物模型和心肌细胞缺氧复氧体外模型,阐明心宝丸及活性成分抗CHF的药效机制,为心宝丸抗CHF临床应用提供实验依据。方法:1.采用大鼠慢性心力衰竭模型评价心宝丸抗CHF药效。SD大鼠行冠状动脉左前降支结扎手术造慢性心力衰竭模型:雄性SD大鼠使用腹腔注射麻药2%戊巴比妥钠后固定在台面上进行气管插管,呼吸机支持大鼠呼吸。沿着大鼠其胸骨接近左缘开口,在第三、四肋骨之间打开胸腔,暴露大鼠心脏后去除心包膜,根据FUT-175抑制剂定位找到其左冠状动脉前降支(LAD),距离左心耳下缘大约3mm处进针,出针后结扎,立刻关闭胸腔并缝合。大鼠造模后第四周行超声心动检测进行筛选,随机分成六组后开始给药四周,假手术(SHAM)组;慢性心力衰竭模型(CHF)组;心宝丸低剂量(40mg/kg);心宝丸中剂量(80 mg/kg);心宝丸高剂量(120 mg/kg),阳性对照药芪苈强心组(0.6 g/kg)。第八周采用超声心动检测评价心功能,取材后心脏组织HE染色观察组织的形态变化,Western Blot检测大鼠心脏组织肥厚因子蛋白β-MHC和心衰因子心房利钠肽ANP蛋白的表达。2.在动物水平上,采用WB检测β2AR、MDM2、βarresein2、GRK2蛋白表达情况,Co-IP实验测定β2AR蛋白泛素化水平,以及β2AR蛋白和NEDD4蛋白、MDM2和βarresein2蛋白的相互作用。在细胞水平上,体外建立H9c2心肌细胞的缺氧复氧细胞模型,并给予不同浓度心宝丸(0.32,0.75,1.5μg/m L)。采用WB检测β2AR、MDM2、βarresein2、GRK2蛋白表达情况。采用Co-IP实验测定细胞中β2AR蛋白泛素化水平。3.采用小鼠慢性心力衰竭模型评价三七皂苷R1抗CHF的药效。C57BL/6J小鼠行冠状动脉左前降支结扎手术造慢性心力衰竭模型,小鼠造模后第四周行超声心动检测进行筛选,随机分成六组后给药四周:假手术(SHAM)组;模型组(CHF)组;低剂量三七皂苷R1组(3 mg/kg);中剂量三七皂苷R1组(10 mg/kg);高剂量三七皂苷R1组(30 mg/kg);阳性对照药缬沙坦(51.96 mg/kg)。在第八周进行超声心动检测评价心功能,取材后对心脏组织进行HE染色,观察组织的形态变化。WB检测小鼠心脏组织肥厚因子蛋白β-MHC和心衰因子心房利钠肽ANP蛋白的表达,检测β2AR、MDM2、βarresein2蛋白表达情况,Co-IP实验测定β2AR蛋白的泛素化水平。在细https://www.selleck.cn/products/lee011.html胞水平上建立H9c2心肌细胞缺氧复氧的体外细胞模型,并给予不同浓度三七皂苷R1(3μM,6μM,12μM);采用WB检测β2AR、MDM2、βarresein2蛋白表达水平的变化。采用Co-IP实验测定细胞中β2AR蛋白的泛素化水平。结果:1.心宝丸可有效改善慢性心力衰竭。超声心动检测结果显示慢性心力衰竭模型组相比假手术组的EF、FS值显著降低。心宝丸中高剂量组(80 mg/kg、120 mg/kg)的EF、FS值显著增加,大鼠心功能得到改善。同时,心脏组织的HE染色结果显示,慢性心衰模型组大鼠的心脏组织细胞核有明显皱缩,心肌组织排列紊乱,炎性细胞浸润明显,心宝丸给药后可显著缓解这些病理现象。WB结果显示模型组大鼠的β-MHC和ANP蛋白明显增加,给予心宝丸中高剂量后可显著降低其表达。体外细胞水平上MTT结果显示,心宝丸给药可显著提高OGD/R后H9c2心肌细胞活力,具有保护心肌细胞的作用。以上结果表明心宝丸具有提高CHF大鼠心功能,抑制心室重构的作用。2.心宝丸可抑制MDM2/βarrestin2/Nedd4介导β2AR泛素化。与假手术组相比,模型组的β2AR蛋白表达明显下降,而给予心宝丸后,可上调β2AR蛋白表达。Co-IP结果显示,模型组β2AR蛋白的泛素化水平明显升高,在心宝丸给药后β2AR蛋白的泛素化水平显著减少。WB结果显示心宝丸给药组与OGD/R组相比,β2AR蛋白的表达水平增加,且β2AR蛋白的泛素化水平下降。进一步机制研究发现:WB结果显示,模型组MDM2和βarrestin2蛋白表达下降,GRK2蛋白的表达增加,心宝丸给药后MDM2和β-arrestin2蛋白表达增加,GRK2蛋白的表达减少。Co-IP结果显示,与假手术组相比,模型组MDM2蛋白和βarrestin2蛋白的相互作用增强,在给予心宝丸后两者相互作用减弱,同时NEDD4与β2AR的相互作用也降低。重要的是,我们发现MDM2抑制剂SP141可减弱心宝丸对OGD/R心肌细胞的保护作用,阻断心宝丸对β2AR蛋白表达上调作用和对β2AR蛋白泛素化抑制作用。以上结果表明心宝丸对β2AR蛋白的调控作用可能与MDM2/βarrestin2招募Nedd4有关。3.三七皂苷R1抗慢性心衰药效机制研究超声心动检测结果显示慢性心力衰竭模型组相比假手术组的EF、FS值显著降低,心功能降低。三七皂苷R1低、中、高剂量(3 mg/kg、10 mg/kg、30 mg/kg)组的EF、FS值显著增加,心功能得到改善。心脏组织的HE染色结果三七皂苷R1可显著改善模型组小鼠心肌细胞核皱缩,组织排列紊乱等病理状态。在细胞水平上,三七皂苷R1能够增加OGD/R后H9c2心肌细胞活力。WB结果表明,与CHF组、OGD/R组相比,三七皂Targeted oncology苷R1组β2AR蛋白表达水平增加。Co-IP结果显示,OGD/R模型组β2AR蛋白的泛素化升高,在三七皂苷R1给药后β2AR蛋白的泛素化水平相对下降。进一步机制研究发现三七皂苷R1处理可显著提高CHF小鼠心脏和OGD/R细胞MDM2和βarrestin2蛋白表达。使用MDM2抑制剂SP141后,三七皂苷R1对OGD/R诱导H9c2细胞保护作用减弱。结论:心宝丸及三七皂苷R1具有改善慢性心力衰竭动物心功能、抑制心室重构的作用。心宝丸及三七皂苷R1能促进β2AR蛋白表达,具体机制可能与抑制MDM2/βarresein2/Nedd4介导的β2AR泛素化及其降解有关。