在炎症的进程中,NLRP3炎症小体的活化起到了关键作用。当先天免疫系统识别外来的病原体比如细菌,病毒等后,会刺激NLRP3炎症小体发生活化,从而诱导巨噬细胞异常分泌IL-1β,推动炎症的发生。在过去的十几年中,人们通过对NLRP3炎症小体结构及其机制的研究,合成了许多NLRP3炎症小体抑制剂,但是大都因为一些副作用而未能用于临床。例如欧苷菊虽然有很好的抗炎活性,但是其生物利用度以及溶解性较差。MCC950,在临床前的一些疾病模型中都取得了很好的效果,但是因为其严重的肝毒性而只能作为工具药,因此我们需要合成并筛选出新型低毒的NLRP3抑制剂。吡唑罗[4,3-d]嘧啶是一个广泛被用于化学合成的活性骨架,Auxin biosynthesis烯丙基被认为是NLRP3炎症小体抑制剂的重要基团。在本研究中,我们通过在骨架的5号位和7号位分别引入烯丙基以及硫代吗啉二氧化物等活性基团,得到多种新型候选化合物并对这些化合物进行活性筛选。体外试验中,我们使用细菌内毒素(脂多糖,LPS)以及尼日利亚菌素(Nigericin)构建体外NLRP3细胞模型,同时用弗氏完全佐剂构建佐剂性关节炎(AA)大鼠模型以及用葡聚糖硫酸钠盐(DSS)诱导构建溃疡性结肠炎小鼠模型进行药效学观察,期望寻找出有效抑制NLRP3炎购买MLN4924症小体的化合物。目的:本研究旨在探寻有效抑制NLRP3炎症小体的新型化合物,并探讨其分子作用机制。方法:1.目标化合物的合成以及谱图鉴定合成候选新型化合物1,2,3,4,并使用碳谱、氢谱对合成出的化合物进行鉴定,判断是否为目标化合物。2.体外实验(1)化合物的细胞毒性评价对化合物的细胞毒性进行评价。提取小鼠骨髓原代巨噬细胞BMDMs,利用PMA(佛波脂)诱导THP-1细胞成巨噬细胞,使用CCK-8检测化合物的细胞毒性。(2)化合物对IL-1β的释放以及细胞焦亡的药理活性研究使用LPS和Nigericin刺激BMDMs以及THP-1细胞激活NLRP3炎症小体,同时用不同浓度化合物干预细胞。收集细胞上清液,使用ELISA、LDH试剂盒检测细胞上清液中IL-1β以及LDH这两种蛋白的含量,同时使用计算机高内涵法检测细胞的焦亡,选取药理活性最好且毒性最低的化合物进行后续实验。(3)化合物2的作用机制研究a.使用LPS和Nigericin刺激BMDMs细胞激活NLRP3炎症小体,使用Western blotting法检测NLRP3炎症小体相关组分蛋白的表达情况。b.同时使用多种NLRP3激动剂例如ATP、MSU分别刺激BMDMs细胞,使用Western blotting法检测NLRP3炎症小体相关组分蛋白的表达情况。c.使用双琥珀酰亚胺辛二酸酯(DSS)交联剂进行ASC交联实验,使用Western blotting法检测NLRP3炎症小体相关组分蛋白以及ASC各分子量蛋白的表达情况。d.使用流式法检测化合物干预后ROS的表达,以及使用免疫荧光检测线粒体膜电位的改变情况。3.体内实验(1)化合物2的动物安全性评价对化合物2的动物毒性进行评价。使用Wistar大鼠雌雄各半,分为给药组与正常组。给药组一次性给予最大药物剂量2000 mg/kg,观察24 h以及14 d内动物体重变化等生理形态,14 d后处死取主要脏器进行病理染色以及血液进行血常规以及生化指标检测。(2)化合物2在AA大鼠模型中的体内药效实验构建佐剂型关节炎AA大鼠模型,模型成功并给药后,检测大鼠体重变化、足肿胀度,并利用关节炎评分细则对AA大鼠关节炎症进行评分。采用HE染色观察给药后大鼠踝关节的病理变化。(3)化合物2在DSS诱导溃疡性结肠炎小鼠模型中的体内药效实验使用3.5%DSS诱导构建溃疡性结肠炎小鼠模型,连续7 d同时给药,记录小鼠体重、DAI评分、结肠长度。采用HE染色观察给药后小鼠结肠的病理变化。结果:1.通过谱图分析,所合成化合物1、2、3、4均为目标化合物。2.体外实验(1)化合物1、2、3在BMDMs与THP-1细胞中均无明显毒性,化合物4的细胞毒性较强。(2)在使用LPS与Nigericin刺激构建的NLRP3炎症小体模型中,化合物2具有较好的抑制IL-1β以及细胞焦亡的效果,因此使用化合物2进行后续实验。(3)a.Nigericin刺激激活NLRP3炎GSI-IX分子式症小体后,使用Western blotting法发现化合物2可以抑制IL-1β以及Caspase-1的释放,但不影响NLRP3炎症小体相关组分蛋白的表达。b.不同的NLRP3炎症小体激动剂激活NLRP3炎症小体后,使用Western blotting法发现化合物2可以抑制不同激动剂引起的IL-1β以及Caspase-1的释放,但也不影响NLRP3炎症小体复合物相关蛋白的表达。c.化合物2不影响ASC总蛋白的表达,但是ASC的聚合随着化合物2浓度的增高而降低。同时ASC斑点实验也观察到随着化合物2浓度的增高,ASC斑点的数量逐渐减少。d.化合物2不抑制炎症小体激活后ROS产生以及线粒体损伤。3.体内实验(1)在给予最大给药剂量2000 mg/kg化合物2后,大鼠各主要脏器病理形态以及血常规,血液生化指标均正常。(2)化合物2有效缓解AA大鼠的关节炎症以及足肿胀度。(3)化合物2有效缓解溃疡性结肠炎小鼠DAI评分以及肠道炎症。结论:1.化合物2抑制体外NLRP3炎症小体的激活。2.化合物2有效改善AA大鼠以及溃疡性结肠炎小鼠炎症。