新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)属于正禽腮腺炎病毒Ⅰ型,可引起禽类烈性传染病且具有很高的发病率和致死率,给家禽养殖业造成严重威胁。除此之外,NDV作为一种溶瘤病毒,能够选择性感染肿瘤细胞。NDV在禽细胞和肿瘤细胞中的高效复制,其势必通过劫持细胞的营养物质而形成病毒与细胞互作的独特的代谢模式。核酸是病毒最基础、最重要的组分,而核苷酸是合成核酸的基础。因此,作为一种在细胞中高效复制的病毒,NDV感染细胞后需要重编程细胞核苷酸代谢途径以支持病毒的核酸合成和其高效复制,其中的机制尚不清楚。本研究从代谢的视角研究NDV对细胞核苷酸代谢途径和中间代谢物的依赖,旨在寻找NDV重塑细胞核苷酸代谢的代谢脆弱点,这有助于从核苷酸代谢的角度理解NDV高效复制的分子机制,具体开展以下几方面的研究:(1)新城疫病毒劫持细胞核苷酸合成途径用于自身复制。为了确定NDV感染是否调控细胞核苷酸代谢途径,本研究首先基于广泛靶向代谢组学检测不同时间点NDV感染A549细胞内代谢物的丰度,筛选出70个具有显著差异的代谢物,并对这些差异的代谢物进行代谢通路富集分析,结果显示代谢物富集程度最高的五项均与核苷酸代谢途径相关,分别为:嘌呤核苷酸、嘧啶核苷酸、尿酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢途径,说明NDV广泛调控核苷酸代谢相关途径。利用靶向嘌呤和嘧啶核苷酸从头合成途径的抑制剂筛选NDV对核苷酸代谢途径的依赖,其中仅嘧啶核苷酸合成阻断可显著的抑制NDV复制,说明NDV对嘧啶核苷酸合成的依赖。此外,NDV还依赖氧化型磷酸戊糖途径为嘧啶核苷酸合成提供五碳糖。(2)天冬氨酸从头合成对新城疫病毒嘧啶核苷酸合成具有重要意义。嘧啶环的原子成分来源于谷氨酰胺和天冬氨酸,有趣的是,NDV复制优先选择从头合成所需的天冬氨酸。而从头合成天冬氨酸所需的碳骨架可由细胞的两大碳源提供:葡萄糖和谷氨酰胺。本研究发现NDV上调了谷氨酰胺和天冬氨酸转运体SLC1A5和SLC1A3的表达。使用[U-~(13)C]Glucose和[U-~(13)C]Glutamine作为同位素底物标记细胞,通过代谢流技术对天冬氨酸合成相关通路进行分析,结果表明:NDV感染细胞后降低了葡萄糖对TCA循环和天冬氨酸的贡献,Amperometric biosensor但选择性上调了谷氨酰胺对天冬氨酸合成的代谢通量,分别通过氧化途径和还原途径。[U-~(13)C]Aspartate代谢流结果说明了NDV诱导增加天冬氨酸贡献于嘧啶核苷酸合成和TCA循环的中间代谢物。尽管NDV分别通过泛素化和自噬的方式诱导GOT1/2降解,但药物抑制和基因干扰实验均证实:GOT1/2在天冬氨酸合成和NDV复制中发挥重要作用。以上结果说明GOT1/2介导的天冬氨酸从头合成对NDV依赖嘧啶核苷酸合成具有重要意义。(3)NDV调控CAD磷酸化以促进嘧啶核苷酸合成。嘧啶从头合成途径除了依赖天冬氨酸提供碳骨架之外,催化嘧啶合成1-3步的限速酶CAD的活性也至关重要。基于NDV复制依赖GOT1/2促进天冬氨酸合成以维持核苷酸可用性,猜想GOT1/2可能通过其他途径参与嘧啶从头合成的调控。为了证实以上猜想,首先通过抑制剂AOA靶向苹果酸-天冬氨酸穿梭途径发现其显著降低CAD磷酸化水平进而抑制NDV复制。机制层面是胞质NAD+/NADH比例降低介导S6selleck NMR磷酸化水平降低进而降低CAD磷酸化水平。重要的是,回补丙酮酸或杜醌可显著上调AOA处理降低的胞质NAD+/NADH比例和CAD磷酸化水平,并拯救NDV的复制。令人意外的是,回补天冬氨酸并没有出现类似的现象,但也拯救了NDV的复制。结果表明苹果酸-天冬氨酸穿梭除了合成天冬氨酸,还维持NAD+/NADH稳态介导CAD磷酸化以促进NDV复制。(4)天冬氨酸合成酶GOT1/2差异调控CAD介导的嘧啶核苷酸合成。苹果酸-天冬氨酸穿梭抑制剂证实其对CAD磷酸化和嘧啶核苷酸合成具有重要意义。进一步分别对GOT1和GOT2进行特异性敲减后,对下游CAD磷酸化进行检测,发现GOT1敲低与AOA处理的现象一致,即GOT1功能是负责将胞质NADH转运至线粒体,从而调控CAD介导的嘧啶核苷酸合成。有趣的是,丙酮酸不能上调因GOT2敲低所降低的S6-CAD磷酸化而抑制的NDV复制,反而是天冬酰胺上调了S6介导CAD磷酸化来回复NDV复制。天冬酰胺并非作为电子受体调控S6-CAD途径的磷酸化,而是通过促进线粒体的代谢活力并伴随增加NADH合成进行调控。上述结果说明了细胞质源GOT1和线粒体源GOT2调控方式的差异:NDV感染细胞后,GOT1通过维持胞质NAD+/NADH稳态介导CAD磷酸化以促进嘧啶核苷酸合成;GOT2介导天冬酰胺合成以维持线粒体NAD+/NADH稳态支持NDV复制。综上所述,本研究主要阐明了NDV感染细胞后调控宿主核苷酸代谢的具体机制,提出了天冬氨酸从头合成途径和CAD活性在病毒嘧啶核苷酸和病毒复制中发挥关键角色。重要的是,发现GOT1和GOT1两种关键代谢靶点,两者通过不同的机制调控病毒嘧啶核苷酸的合成。本研究结果对深入解析NDV在细胞中高效复制的分子机制具有重要意义,为病毒-核苷酸代谢研究提供了新的思路,也为靶向核苷酸代谢的抗病毒药物的研发提供了理论基点击此处础。