腈水合酶(Nitrile Hydratase,简称NHase,EC 4.2.1.84)是一种能够催化腈类化合物水合生成酰胺类物质的金属酶。腈水合酶通常由α和β两个亚基组成,其基因簇下游存在一个调控蛋白基因,可帮助酶本体摄取金属离子完成翻译后修饰。在公共基因库里挖掘到来源于玫瑰单胞菌Falsiroseomonas stagni DSM 19981的两种潜在的腈水合酶,均含有钴型腈水合酶的特异性钴结合氨基酸基序Cys-Thr-Leu-Cselleck合成ys-Ser-Cys。第一种潜在的NHase(Fs NHase),由三个亚基组成,其中一个亚基与传统腈水合酶的α亚基相似,其余两个亚基分别与常规腈水合酶β亚基的C端和N端相似;另一种潜在的NHase(αp14k)基因型较为特殊,编码α亚基与调控蛋白的基因天然融合为一个基因,不含编码β亚基的基因。本研究于大肠杆菌基因工程菌中异源表达了这两种潜在的腈水合酶,分别对其性质进行测定,并且探究了两者的相互作用关系。主要研究结果如下:(1)表达纯化Fs NHase并测定其对烟腈、丙烯腈和硫氰酸钾的比酶活,解析其水合腈类和水解硫氰酸钾活性互通的机制。在大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)里成功表达了Fs NHase,并通过硫酸铵沉淀、阴离子交换层析、凝胶过滤层析,获得了高纯度的Fs NHase。Fs NHase的最适p H为7,最适温度为40℃,在最适条件下对烟腈、GDC-0973价格丙烯腈、硫氰酸钾的比酶活分别为17.8±1.3 U·mg~(-1),30.6±1.9 U·mg~(-1),13.5±0.9 U·mg~(-1)。常规腈水合酶不具备硫氰酸水解酶活性,基于三维结构比对,位于Fs NHase底物结合口袋顶部氨基酸的不同可能是其存在腈水合酶与硫氰酸水解酶活性互通的原因。(2)异源表达、纯化天然融合型αp14k复合体,探究天然不含β亚基的αp14k是否可独立行使腈水合酶的功能。通过高效异源表达及纯化,获得了高纯度的天然融合型αp14k。通过凝胶过滤层析明确αp14k主要以单聚体形式存在于溶液中;对天然融合型αp14k复合体的酶学性质进行表征,αp14k催化烟腈的最适温度为45℃,最适p H为7.4,最适条件下催化烟腈的比酶活为12.77±0.18 U·mg~(-1)。电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)表明,每个融合型αp14k复合体可以结合0.47个钴离子。同一宿主的Fs NHase和αp14k体内/体外PIN-FORMED (PIN) proteins激活结果显示在体内和体外条件下αp14k对Fs NHase均没有激活作用,因此确认αp14k可独立行使腈水合酶功能。(3)通过构建突变体库,筛选αp14k催化能力提升的优势突变体。通过虚拟筛选的方法构建了小而精的突变体库,从中获取了一个催化烟腈比酶活比野生型提升3.6倍的突变体R250A,其活性达到了30.01±0.6 U·mg~(-1);研究了连接α亚基和p14k中间一段富含组氨酸的linker的作用,构建了删除linker的突变体M1和替换linker成五个氨基酸GGGGS的突变体M2。M1催化烟腈的活性为44.15±0.37 U·mg~(-1),M2的活性为41.31±0.31 U·mg~(-1),结果表明该linker对水合活性可能有抑制作用。