研究背景:随着我国航天事业快速发展,航天员在轨时间逐渐延长。航天飞行期间,航天员骨骼肌特别是抗重力肌将出现肌肉质量和力量的持续下降,不仅影响航天员的身体健康和工作效率,还会影响航天员返回地面后的活动能力。探讨失重性肌萎缩的分子机制并寻找有效的防护措施一直是该领域的重要问题。近年的研究表明,时间限制性进食(time-restricted feeding,TRF)可通过减少每日摄入食物的时间窗发挥一定的健康效应,包括延缓衰老、改善代谢、预防癌症等。我们课题组前期研究表明,TRF可改善模拟失重引起的心脏功能障碍,但TRF能否对抗模拟失重引起的肌肉萎缩、有益于Biomimetic materials骨骼肌健康尚不清楚。目的:明确TRF能否改善失重性肌萎缩并探讨其机制。方法:1.利用尾悬吊(hindlimb unloading,HU)使后肢去负荷以建立小鼠模拟失重模型。TRF干预:小鼠在每日授时因子时间(ZT14:熄灯后2 h)至(ZT22:开灯前2h)内进食,其余时间不能进食、但可自由饮水。对照组小鼠任何时间均可自由进食。2.利用跑台力竭实验检测小鼠运动能力的变化。利用HE染色、免疫荧光染色检测比目鱼肌肌纤维直径、肌纤维横截面积(cross sectional area,CSA)及微血管密度。利用免疫磁珠分离原代小鼠骨骼肌微血管内皮细胞,检测其衰老相关分子标志物p16、p53和衰老相关分泌表型(senescence associated secretory phenotype,SASP)IL-1α、IL-6的含量以及衰老特异性的β-半乳糖苷酶(SAβ-gal)染色变化情况。3.利用GEO2R分析工具将从GEO数据库获取失重后小鼠比目鱼肌基因芯片测序数据集与本课题组TRF干预后小鼠骨骼肌转录组数据集进行联合分析,筛选出差异基因并进行KEGG通路富集分析;q RT-PCR进一步验证关键差异基因Serpine1的变化。免疫组化和Western Blotting进一步检测小鼠比目鱼肌内Serpine1基因的转录蛋白—纤维蛋白溶酶原激活物抑制剂-1(plasminogen activator inhibitor-1,PAI-1)的表达变化。4.分别收集Control、HU、HU+TRF组小鼠血清,ELISA检测血清中PAI-1的含量。将不同处理组小鼠血清添加到无血清培养基中培养HUVECs,Western Blotting和免疫荧光检测HUVECs内p21、p53和γ-H_2AX的表达变化情况。5.利用transwell小室构建人骨骼肌细胞(HSMCs)和人脐静脉内皮细胞(HUVECs)共培养体系;利用2D回转器建立细胞模拟失重(SM)模型;利用无血清培养基给予细胞饥饿处理(Fasting)以模拟在体TRF干预时体内细胞缺乏营养的环境~([1])。6.构建小鼠骨骼肌细胞特异性过表达PAI-1腺相关病毒(AAV-PAI-1)及其阴性对照(AAV-NC)。将病毒在小鼠后肢进行肌肉点注射,利用小动物活体成像、Western Blotting和免疫荧光检测病毒感染效率。7.所有实验数据均采用SPSS18.0统计软件进行分析。数据结果通过t检验或单因素方差分析统计分析。结果表示为平均值±标准误。P<0.05被认为具有统计学意义。实验结果:1.TRF改善模拟失重小鼠骨骼肌萎缩,减缓微血管内皮细胞衰老与Control组相比,HU组小鼠跑台运动力竭时间和距离均降低、比目鱼肌质量降低、肌纤维直径和CSA减小、肌肉微血管密度下降,提示模拟失重导致小鼠肌肉力量和质量均显著下降;与自由进食组相比,TRF饮食可显著延长HU小鼠运动力竭时间和距离、增加比目鱼肌质量以及微血管密度。分离小鼠骨骼肌微血管内皮细胞发现,与Control组相比,HU组小鼠内皮细胞呈现衰老表型:SAβ-gal阳性细胞数量显著增加;p16和p53表达显著增高;IL-1α和IL-6 m RNA含量增多。与自由进食组相比,TRF饮食可改善HU小鼠骨骼肌微血管内皮细胞的上述衰老变化。2.TRF抑制模拟失重小鼠骨骼肌Serpine1及其蛋白PAI-1表达数据集联合分析结果显示,表达趋势相反的差异基因共57个;利用q RT-PCR进一步验证发现差异基因中Serpine1表达与失重性肌萎缩、TRF干预均密切相关。与ContCobimetinibrol组相比,HU组小鼠比目鱼肌Serpine1 m RNA含量和PAI-1表达量显著升高;与年轻小鼠相比,老龄小鼠比目鱼肌PAI-1表达显著升高。TRF干预可降低HU小鼠比目鱼肌的上述变化。3.TRF改善模拟失重小鼠血清诱导的内皮细胞衰老与Control组相比,HU组小鼠血清中PAI-1含量显著升高。而TRF干预可显著降低血清PAI-1含量。与Control组相比,添加HU组血清的HUVECs衰老表型明显,表现为p21、P53和γ-H_2AX表达显著增高点击此处,而TRF则可改善HU组小鼠血清诱导的内皮细胞衰老。4.模拟失重促进骨骼肌细胞PAI-1分泌,诱导内皮细胞衰老与Control组相比,SM组骨骼肌细胞Serpine1 m RNA含量和PAI-1蛋白表达量显著升高、培养液中PAI-1分泌显著增加;与上述骨骼肌细胞共培养的内皮细胞呈现衰老表型,表现为p16和p53含量显著增高、SAβ-gal阳性细胞数量显著增加。Fasting处理则可改善模拟失重诱导的内皮细胞衰老。5.骨骼肌细胞特异性过表达PAI-1可阻断TRF对小鼠失重性肌萎缩的保护效应病毒感染2周后,与AAV-NC组相比,AAV-PAI-1组小鼠比目鱼肌PAI-1表达显著升高;病毒感染6周后,与AAV-NC+HU组相比,AAV-NC+TRF组小鼠的跑台运动力竭时间和距离、肌肉质量、肌纤维直径、CSA以及微血管密度均有所改善;但是与AAV-PAI-1+HU组相比,AAV-PAI-1+TRF组小鼠的上述指标无显著变化。这些结果提示,骨骼肌细胞特异性过表达PAI-1可阻断TRF对小鼠失重性肌萎缩的保护效应。结论:模拟失重可致骨骼肌细胞PAI-1合成增加,后者可致内皮细胞衰老减少骨骼肌微血管密度,从而加重失重性肌萎缩发生发展。TRF可通过抑制骨骼肌细胞PAI-1的产生和分泌,延缓微血管内皮细胞衰老,改善模拟失重所致的骨骼肌萎缩,可能成为对抗失重不良效应的一种潜在策略。