【背景】口腔钛种植体在临床上被广泛应用,可替代缺失牙根并与天然骨组织形成骨结合,是目前修复缺失牙的理想选择,但仍面临愈合时间长、骨结合不良等问题。骨结合发生在种植体表面与相邻接的骨组织之间,因此,材料表界面是影响骨结合的关键因素。通过对种植体的表界面进行仿生修饰,有望使种植体获得更理想的骨结合能力。仿生的理念要求材料表界面在多种理化特征上尽可能地与骨组织保持一致或相互协调,包括表面化学组成、表面形貌、润湿性、表面电荷、表面手性等。骨组织在微观上是由横截面约几十纳米的矿化胶原纤维构成的,因此材料表面应具有与骨胶原纤维相匹配的纳米尺度形貌特征。另外,由于构成细胞外基质的多糖、蛋白质等生物分子都是具有手性的,故材料表面也应具有与骨组织相适应的手性特征。我们课题组经过多年系列探索,提出了钛表面纳米形貌的仿生理念。在此基础上,本研究进一步提出手性仿生的概念,构建出了具有手性特征的纳米形貌。为了对纳米形貌的尺度范围和手性的类型进行合理的选择,需全面考虑骨愈合过程中的参与细胞对材料表面的反应。良好的骨结合不仅需要干细胞、成骨细胞、成血管细胞等直接参与形成骨组织,也需要免疫系统在其中发挥骨稳态维持和调节作用。以巨噬/破骨细胞为核心的骨免疫调控近年来备受关注。巨噬细胞可通过动态可塑的极化表型分泌多种细胞因子调节成骨过程,破骨细CB-839小鼠胞兼具骨吸收和旁分泌耦合成骨的功能。二者都起源于单核细胞,互为补充,相互协调,作为动态整体共同维持骨稳态的平衡。但是,材料表面的形貌特征和手性特征如何影响巨噬细胞极化和破骨分化,以及细胞因子分泌谱的变化对骨再生的调节作用如何目前尚未完全阐明。探讨这两种表面特征对巨噬/破骨细胞的调控规律和机制将有助于深入理解材料表面与机体骨免疫系统的互作规律,为骨植入材料表面的仿生设计提供新的策略。【目的】基于课题组前期对纳米形貌调控巨噬细胞功能表型的研究基础,进一步明确纳米形貌如何调节破骨分化及其中的具体分子机制;探究纳米形貌刺激下的巨噬细胞和破骨细胞对骨再生的影响;探讨手性特征和纳米形貌特征在调控巨噬细胞极化和骨生成中的相互关系和重要性;阐明材料表面手性特征影响巨噬细胞极化的关键机制。【方法】第一部分:材料表面的形貌特征对巨噬/破骨细胞的调控作用和机制1.采用酸蚀法构建钛表面的微米坑形貌(micropitted topography,MT),采用阳极氧化法进一步构建微米坑/纳米管复合形貌(micropit-nanotube topography anodized,MNT),根据电压的不同将各表面分别命名为MNT5、MNT10、MNT15和MNT20,以光滑钛(polished titanium,PT)表面作为对照;扫描电镜(scanning electron microscope,SEM)、原子力显微镜检测表面形貌和粗糙度;接触角测量仪检测表面亲水性。2.在各表面接种培养RAW264.7巨噬细胞,添加RANKL因子诱导破骨分化;抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphatase,TRAP)染色和TRAP活性定量评价破骨细胞骨吸收能力;RT-q PCR和western blot(WB)检测破骨标志基因和蛋白的表达;SEM和免疫荧光染色观察破骨细胞的形态和细胞骨架等结构;ELISA检测两种分别具有成骨正向和负向调控作用的破骨细胞因子(clastokines)分泌水平。3.进一步选择PT表面和MNT5表面的破骨细胞进行蛋白质组学检测和功能富集分析;WB实验检测整合素(Integrin)-黏着斑激酶(focal adhesion kinase,FAK)-丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)通路的表达情况,并在添加FAK磷酸化抑制剂和p38磷酸化抑制剂后通过WB进行验证。4.小鼠股骨内分别植入PT和MNT5形貌钛试样,2周内不同时间点分别取材,行骨组织骨桥蛋白(osteopontin,OPN)和F4/80免疫荧光染色、TRAP染色以及MicroCT检测。5.提取PT和MNT5表面巨噬细胞和破骨细胞的培养上清,制备条件培养基,用于培养MC3T3-E1成骨细胞;RT-q PCR检测成骨标志基因的表达,碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)染色和ARS染色分析ALP活性和细胞外基质矿化水平;此外,使用RT-q PCR检测破骨细胞分泌的9种clastokines的水平,使用小鼠细胞因子芯片高通量分析巨噬细胞细胞因子的分泌。第二部分:材料表面的手性特征对巨噬细胞的调控作用和机制1.采用旋涂和煅烧法制备两种不同间距的纳米金阵列,使用偶联剂将纳米金阵列转移至聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)凝胶表面,通过左旋(L型)或右旋(D型)半胱氨酸的修饰赋予表面不同的手性特征。使用SEM、接触角测量仪对各表面进行表征,通过XPS采集各表面的Au元素和S元素的高分辨率窄谱。2.在各表面培养RAW264.7巨噬细胞和小鼠骨髓来源巨噬细胞(bone marrow derived macrophages,BMDMs),CCK-8实验检测RAW264.7的增殖情况;SEM观察各表面RAW264.7和BMDMs的细胞形态,RT-q PCR、ELISA、流式细胞术检测巨噬细胞极化标志物的表达和分泌水平;小鼠细胞因子芯片分析RAW264.7和BMDMs的细胞因子分泌情况;间接共培养实验评价各表面RAW264.7细胞对MC3T3-E1成骨的调控作用;使用transwell共培养系统评价各表面BMDMs对小鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMMSCs)成骨分化的调控作用;各组凝胶植入小鼠皮下2、7天后对试样周围皮肤组织取材,HE染色分析纤维包膜厚度,免疫组化染色分析巨噬细胞极化标志分子的表达水平。3.对不同手性表面的RAW264.7细胞行转录组学分析;XPS和表面等离子体共振(surface plasmon resonance,SPR)实验检测纤连蛋白(fibronectin,FN)在不同手性金表面的吸附情况;使用精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-丝氨酸(Arg-Gly-Asp-Ser,RGDS)抑制FN与细胞膜表面Integrin的结合后,通过流式细胞术检测BMDMs极化标志分子的表Bafilomycin A1达情况;在使用RGDS抑制Integrin与FN的结合前后分别收集各组RAW264.7细胞蛋白样本,WB检测可与FN结合的Integrin各亚基、FAK以及极化标志蛋白的表达。【结果】第一部分:材料表面的形貌特征对巨噬/破骨细胞的调控作用和机制1.抛光后的钛表面光滑,酸蚀后的钛表面出现微米坑结构,根据阳极氧化电压的大小不同分别构建出管径约为30、50、70、100 nm的纳米管阵列。相较于PT表面,纳米管阵列的修饰使表面的粗糙度上升,水接触角降低,其变化程度与管径呈正相关(P均＜0.05)。2.破骨细胞的TRAP染色阳性量和TRAP活性在PT表面最高,MT表面其次,MNT表面最低且随管径的增大而降低(P均＜0.05);破骨细胞形态的典型程度、破骨标志基因和蛋白的表达呈现类似趋势(P均＜0.05)。相较于PT和MT表面,MNT表面破骨细胞高表达促成骨的肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,Hgf),低表达抑制成骨的硬骨素(sclerostin,Scl),且MNT5组的Hgf表达水平最高,Scl表达水平最低(P均＜0.05)。3.PT和MNT5表面破骨细胞的蛋白质组学差异蛋白主要与细胞的黏附功能有关,具体涉及黏着斑、整合素等。MNT5表面破骨细胞的Integrinβ1、p-FAK、p-p38蛋白表达下调,FAK磷酸化抑制剂进一步降低了p-p38和破骨标志蛋白的表达,p38磷酸化抑制剂也降低了破骨标志蛋白的表达(P均＜0.05)。4.钛试样植入小鼠股骨2周后,MNT5组周围的骨量显著多于PT组(P＜0.05);植入后3、7、14天,植体周围骨组织OPN的表达量逐渐增高,F4/80的表达量先增加后减少,但MNT5组中二者的表达均高于PT组(P均＜0.05);MNT5组在第3天时的TRAP染色阳性量较高,但第5天和第7天均低于PT组(P均＜0.05)。5.PT表面的破骨细胞条件培养基抑制了MC3T3-E1细胞的成骨基因表达、ALP活性和细胞外基质矿化能力,而MNT5表面可减轻这种抑制作用(P均＜0.05)。MNT5表面上调了5种促成骨的clastokines表达,下调了2种抑制成骨的clastokines的表达(P均＜0.05)。与破骨细胞相反,PT表面的巨噬细胞条件培养基促进了MC3T3-E1细胞的成骨基因表达、ALP活性和细胞外基质矿化能力,且MNT5表面可增强这种促进作用(P均＜0.05)。细胞因子芯片结果显示,MNT5表面有利于巨噬细胞分泌与细胞分化和增殖、成骨和成血管有关的M2极化细胞因子,而不利于与炎症反应以及肿瘤坏死因子反应相关的M1极化细胞因子的分泌。第二部分:材料表面的手性特征对巨噬细胞的调控作用和机制1.根据合成体系的不同,在PEG凝胶表面成功制备出间距分别为300和900 nm的点状纳米金阵列,通过手性半胱氨酸修饰进一步构建出不同手性的纳米金阵列,分别命名为L-300,D-300、L-900、D-900。手性修饰后凝胶表面的接触角显著降低(P＜0.05)。XPS检测出163.8 e V处的S元素特征峰,并且证实900 nm间距金表面的Au元素含量更高。2.不同手性和间距的纳米金阵列表面对RAW264.7细胞增殖活性的影响无显著性差异(P＞0.05)。RAW264.7细胞在L-纳米金阵列表面的伸展面积增大,M1极化相关基因和蛋白的表达增强,且在L-300表面表达水平最高(P均＜0.05);相反,在D-纳米金阵列表面伸展不充分,M2极化相关基因和蛋白的表达增强,且在D-300表面表达水平最高(P均＜0.05)。D-纳米金阵列表面RAW264.7细胞的条件培养基上调了MC3T3-E1细胞成骨基因的表达,促进了ALP活性和细胞外基质矿化水平,且D-300表面的促进作用最明显(P均＜0.05)。相比于L-300表面,D-300表面的BMDMs在细胞形态、极化标志分子的表达、调节BMMSCs成骨分化方面显示出与RAW264.7细胞类似的趋势(P均＜0.05)。在小鼠皮下hepatic tumor凝胶植入实验中,相比于L-300表面,D-300表面组织的CD206阳性染色显著增多,CCR7阳性染色显著降低,纤维包膜的厚度也显著降低(P均＜0.05)。3.转录组测序结果显示,L-300和D-300表面的巨噬细胞差异表达的基因在Integrin信号通路中显著富集。相比于L-金表面,FN溶液流过D-金表面时SPR信号值更高;相比于L-300表面,D-300表面的N元素含量更高。流式结果表明,向培养液中加入RGDS后,L-300和D-300表面BMDMs的CD206表达无显著性差异。WB结果显示,相比于L-300表面,RAW264.7在D-300表面的Integrinαv、Integrinα8、Integrinβ3、p-FAK及精氨酸酶1(arginase 1,Arg1)表达上调,i NOS表达下调;在加入RGDS后,上述蛋白表达的差异消失。【结论】1.纳米管形貌可通过Integrinβ1-FAK-MAPK通路抑制破骨分化,其抑制作用与管径成正相关,但过大管径的纳米管不利于破骨细胞耦合成骨。2.管径约30 nm的纳米管表面可通过促进巨噬细胞分泌抗炎细胞因子,抑制巨噬细胞分泌促炎因子,以及调节破骨细胞因子的分泌,从而促进骨组织再生。3.在对巨噬细胞表型及分泌功能的调控中,纳米金阵列的手性特征相比于形貌特征是更为重要的因素。4.右旋手性的纳米金阵列有利于FN的吸附,进而可被细胞膜表面整合素识别,激活巨噬细胞的Integrinαv/α8/β3-FAK通路,最终促进巨噬细胞M2极化和组织修复。