云南马尾松花粉多糖及酯化多糖可以提高机体免疫功能,前期研究表明松花粉多糖及酯化多糖可缓解DSS(葡聚糖硫酸钠)诱导的溃疡性结肠炎,其与调节Th17、Treg细胞失衡及RIPK3介导的程序性坏死通路有关。但是,DSS本质也属于酯化多糖,DSS能诱导结肠炎而松花粉酯化多糖却能缓解结肠炎,原因尚不明确。实验室前期研究已证实松花粉酯化多糖可通过增加[Ca~(2+)]i提高免疫活性,因此首先推测DSS会诱导结肠炎可能与降低[Ca~(2+)]i有关,然而预实验结果表明DSS同松花粉酯化多糖一样增加了[Ca~(2+)]i,假设不成立。炎症与氧化应激息息相关,且RP56976说明书松花粉多糖、酯化多糖及DSS对LPS(脂多糖)诱导的RAW264.7细胞氧化损伤及炎症有何影响未有研究,因此本篇论文的研究内容以氧化应激及炎症为落脚点,探究其原因。是否松花粉多糖及酯化多糖会缓解LPS诱导的氧化应激及炎症,而DSS会加剧LPS诱导的氧化应激及炎症尚未可知,论文围绕此问题进行探究。研究包含下面七部分:一.提取松花粉多糖并进行过柱分离及酯化。依照实验室前期方法提取多糖,定名为PPM60。PPM60经Sephacryl ~(TM)S-400柱纯化,得第三组分定名为PPM60-Ⅲ。氯磺酸-吡啶法对PPM60-Ⅲ进行酯化,得酯化多糖定名为SPPM60-Ⅲ。二.培养RAW264.7细胞,CCK-8测细胞活性,TUNEL法测凋亡。对于RAW264.7细胞活性,PPM60-Ⅲ及SPPM60-Ⅲ呈现先增后减的趋势,DSS呈现浓度依赖的抑制作用。对于LPS诱导的细胞凋亡,PPM60-Ⅲ、SPPM60-Ⅲ及DSS均起到了缓解作用。三.试剂盒测细胞中ROS(活性氧)水平、细胞抗·O_2~-(超氧阴离子自由基)与·OH(羟自由基)能力及MDA(丙二醛)水平。PPM60-Ⅲ与SPPM60-Ⅲ均显著抑制了RAW264.7细胞中ROS及MDA的水平,但DSS并未表现出此现象。除此之外,PPM60-Ⅲ与SPPM60-Ⅲ均提高了细胞抗·O_2~-及·OH的能力,起到了抗氧化作用。然而,DSS并未显著提高细胞抗·O_2~-及·OH的能力。四.试剂盒测细胞中IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-10与NO的含量。PPM60-Ⅲ与SPPM60-Ⅲ降低了RAW264.7细胞中促炎因子IL-1β、IL-6、TNF-α及NO的水平,提高了抗炎因子IL-10的含量,抑制了细胞中的炎症。然而,DSS进一步加重了LPS导致的NO的生成,进一步降低了抗炎因子IL-10的含量,一定程度上加剧了细胞炎症带来的损伤。五.蛋白印迹分析SOD2(超氧化物歧化酶2)、CAT(过氧化氢酶)、GR(谷胱甘肽还原酶)、GPx4(谷胱甘肽过氧化物酶4)、NOX(NADPH氧化酶)、i NOS(诱导型一氧化氮合酶)氧化还原酶水平。对抗氧化酶SOD2、CAT、GR、GPx4,PPM60-Ⅲ与SPPM60-Ⅲ均增强了其表达水平;相反,DSS减弱了其表达水平。对于氧化酶NOX、i NOS,PPM60-Ⅲ与SPPM60-Ⅲ均减弱了其表达水平;相反,DSS增强了其表达水平。进一步验证了PPM60-Ⅲ与SPPM60-Ⅲ能抵抗LPS诱导的氧化应激,DSS却加剧了LPS导致的氧化应激。六.蛋白印迹分析Keap1-Nrf2信号通路中Keap1、Nrf2、Nrf2(细胞核)、Nrf2(细胞质)、HO-1、NQO-1、GCLM、GCLC蛋白水平。Keap1-Nrf2信号通路是机体防御氧化应激及炎症损伤的重要机制,在细胞代谢中也发挥重要作用。PPM60-Ⅲ与SPPM60-Ⅲ增强了Nrf2、NQO-1、GCLM、GCLC、HO-1抗氧化蛋白表达水平,而DSS进一步减弱了LPS诱导的Nrf2、NQO-1、GCLM、GCLC、HO-1抗氧化蛋白表达水平的降低。PPM60-Ⅲ与SPPM60-Ⅲ均减弱了LPS诱导的Keap1表达水平的升高,而DBMN 673 IC50SS进一步增强了Keap1的表达水平。除此之外,PPM60-Ⅲ与SPPM60-Ⅲ均能促进Nrf2的核移位,DSS却抑制Nrf2的核移位。说明PPM60-Ⅲ与SPPM60-Ⅲ能抵抗氧化应激及炎症,而DSS却加剧Lipid-lowering medication氧化应激及炎症与Keap1-Nrf2通路有关。七.代谢组学筛选差异性代谢物。氧化应激及炎症与代谢的改变也息息相关,多元统计分析结果表明每两组间差异性代谢物均能很好地分散开,所包含到的代谢途径重点包括糖代谢、氨基酸代谢等。PPM60-Ⅲ与SPPM60-Ⅲ能平衡LPS诱导的糖代谢及氨基酸代谢紊乱从而一定程度上缓解氧化应激及炎症,DSS则能进一步紊乱糖代谢与氨基酸代谢从而一定程度上加剧氧化应激及炎症。综上,PPM60-Ⅲ与SPPM60-Ⅲ能通过活化Keap1-Nrf2信号通路抵抗氧化应激及炎症从而增强细胞活性,DSS则能通过抑制Keap1-Nrf2信号通路加剧氧化应激及炎症从而抑制细胞活性,且这与糖代谢、氨基酸代谢等息息相关。