柑橘衰退病,是柑橘绿色发展受到严重威胁的一种病害。这种病害已经导致全球数亿棵柑橘树死亡。想要明确病因和病害之间的关系,有效地防止这种病害,必须深入了解CTV的病原体种群组成,以及采用高效检测和鉴定CTV基因型。这是实现病害控Four medical treatises制和柑橘绿色发展的基础。明确CTV种群中是否存在新的分离株及其分子和生物学特性,为CTV病原防控提供理论依据。高效、准确鉴定CTV基因型组成,为更好的防控CTV提供技术支持。本研究在道县野橘上鉴定到了一种新的CTV分离株,并获得该分离株的全序列。同时,建立高效的基因型多重RT-PCR鉴定方法,其结果如下:1、CTV新基因型鉴定:宏病毒组测序与RT-PCR和RACE-PCR验证获得了1个道县野橘CTV毒株(JY-2)的全基因组序列,其基因组全长为19112 nt,登录号ON094625。对已报道的CTV基因型分离株和JY-2进行同源序列及系统发育分析后发现,JY-2与其他已知的CTV基因型存在明显区别,且独立存在。JY-2全基因组序列差异大于7.5%、Canagliflozin抑制剂ORF1a核苷酸和氨基酸序列差异大于8%,因此认定JYselleck Naporafenib-2变体为新的基因型,命名为JY基因型。2、JY新基因型发生情况检测及其分离物遗传特性:旨在鉴定JY的基因型并建立适用于CTV的新基因型检测体系。为此,设计了一组引物,其设计依据p6区域核苷酸的差异性。随后,进行了RT-PCR验证。最终,建立了这一新的基因型检测体系。利用该体系对9个栽培主产区和4个野生柑橘地区的柑橘样品进行JY基因型检测,仅在江永道县野橘样品中检出12个阳性样品。12个分离物通过分子克隆其分离物的ORF1b、p33、p25、p23基因序列,与已报道的CTV基因型分离株对应基因序列进行序列同源性分析,遗传分化与种群动态分析,分子变异分析及主成分析和系统发育分析。结果发现JY分离物4个基因之间序列相似性较高,说明JY基因型种群内的遗传变异较少,种群较为稳定。JY基因型与CTV其他基因型存在明显的遗传分化,CTV野生柑橘种群与栽培柑橘种群的差异非常大,且基因交流小;JY分离物聚集在同一簇,且独立于已知的CTV基因型之外。3、构建CTV基因型多重RT-PCR鉴定体系:从NCBI上下载CTV各基因型的参考序列,并在核苷酸序列差异明显的位置上设计引物,并通过特异性、通用性以及测序验证筛选得到各基因型鉴定的理想引物。将筛选得到的各基因型鉴定引物根据扩增片段大小且引物之间互不干扰进行组合,设计出两套基因型多重鉴定体系。通过调整、优化体系参数最终得到两套稳定的多重鉴定体系。用质粒的10倍梯度稀释检测多重体系的灵敏度。实验发现两套体系的灵敏度能达到1.65μg/μL。同时运用单基因型鉴定体系与多重鉴定体系的检测结果进行比对,结果显示基因型鉴定结果一致。