背景:血管新生贯穿类风湿关节炎(Rheumatoid arthritis,RA)整个病程,参与滑膜恶性增生,血管翳形成以及软骨和骨损伤。在炎性状态下,由血管内皮细胞(Vascular endothelial cells,VECs)组成的血管系统的代谢平衡被打破,活化的VECs为应对激增的能量与物质需求而选择有氧糖酵解作为主要代谢方式。相较于氧化磷酸化,糖酵解由于其快速的ATP供应满足细胞增殖,出芽等生物学功能的需求,同时代谢中间产物还作为细胞间交流的重要信号。滑膜炎性微环境中的糖代谢重编程决定了糖酵解代谢在RA血管新生中的重要作用,因此明确内皮糖代谢方式的变化可能为RA的血管新生抑制疗法提供新策略。栀子苷(Geniposide,GE)作为中药栀子主要有效成分,发现对实验性关节炎具有显著的治疗作用,通过抑制鞘氨醇激酶1(Sphingosinekinases,Sph K1)及其下游信号介导的炎症反应和血管新生;而具有多羟基活性结构的GE与Sph K1结合位点预测,提示了GE作用的潜在靶点。但GE在细胞水平上的作用方式尚不明确。因此,本课题筛选并验证与RA相关的糖代谢差异代谢物,从细胞和分子代谢层面探讨RA糖酵解代谢参与血管新生的机制,进而为RA血管新生抑制疗法提供新思路和新方向。目的:筛选并验证与RA相关的糖酵解途径差异代谢物,明确PFKFB3是否为关键限速酶,阐明GE在胞内发挥活性,通过靶向Sph K1调控PFKFB3介导的糖酵解代谢在RA血管新生中的作用;从内皮糖代谢重编程的视角阐释RA血管新生的发病机理,为GE发挥RA血管新生抑制疗法提供实验依据。方法:1.建立AA大鼠和TNF-α诱导的HUVECs炎性细胞模型,构建糖酵解途径特征样品处理方PI3K/Akt/mTOR抑制剂法及分析方法,结合UPLC-Q-TOF/MS和UPLC-MS/MS建立代谢组学分析平台,对RA患者血液、AA大鼠滑膜组织、HUVECs细胞裂解液进行分离鉴定,筛选出潜在差异代谢物并对目标代谢物进行含量测定。通过WB和ELISA方法对筛选出的限速酶进行功能验证。2.采用HE、IHC、WB方法检测AA大鼠和TNF-α诱导的HUVECs的糖酵解代谢水平及信号蛋白的表达;Sph K1-si RNA检测胞内信号蛋白的表达和糖酵解水平,证明Sph K1参与调节糖酵解途径。分别采用信号通路特异性激动剂及抑制剂干预,检测信号蛋白表达,明确Sph K1-PI3K-Akt-PFKFB3信号的上下游关系。采用WB和免疫共沉淀法(CO-IP)分别检测信号蛋白Sph K1、PI3K、Akt和PFKFB3的总蛋白和磷酸化蛋白水平,以及蛋白之间的相互作用;检测胞内葡萄糖摄取含量、胞内乳酸堆积含量以及荧光葡萄糖类似物2-NBDG的流式和荧光成像分析检测糖酵解代谢水平。3.采用UPLC-Q-TOF/MS检测FLSs和HUVECs胞内的GE;通过化学合成FITC-GE,采用激光共聚焦分析FITC-GE的胞内分布和亚细胞定位,为GE在胞内发挥作用提供可视化验证。对GE和Sph K1抑制剂PF543干预的AA大鼠和TNF-α诱导的HUVECs,通过WB和CO-IP分析信号总蛋白和磷酸化蛋白的表达;分别采用CCK-8、迁移、成管和基质胶栓实验,检测HUVECs增殖、迁移和成管能力,分析GE对体外模型血管新生的影响。结果:1.GE干预实验性关节炎模型糖酵解代谢水平的代谢组学分析进行RA患者血清和AA大鼠滑膜组织代谢组学分析,分别鉴定出11个和13个影响疾病的糖酵解代谢产物,结合定量测定结果,显示RA患者血清中葡萄糖含量降低,乳酸等代谢产物的含量增加,而AA大鼠滑膜组织和TNF-α诱导的HUVECs细胞模型中糖酵解代谢产物的含量均增加。GE干预后显著缓解AA大鼠的运动表现、关节症状及滑膜病理情况,下调AA大鼠滑膜组织和HUVECs细胞中的糖酵解代谢产物含量,且不同程度的回调AA大鼠滑膜组织中6个糖酵解代谢产物。结合WB对限速酶表达验证结果,GE显著下调PFKFB3表达及其催化产物2,6-二磷酸果糖的含量,但对PFK1表达无显著影响。表明实验性关节炎中糖酵解代谢异常升高,GE发挥治疗作用可能与抑制PFKFB3介导的糖酵解代谢有关。2.Sph K1调控PFKFB3诱导内皮糖酵解代谢的机制探究体外构建有氧或缺氧条件下TNF-α诱导的HUVECs模型,检测发现胞内葡萄糖摄取及乳酸累积量均增加,表现为有氧糖酵解代谢方式;检测AA大鼠和HUVECs中目标总蛋白和磷酸化蛋白,发现Sph K1、PI3K-Akt信号及PFKFB3均被过度激活。通过Sph K1-si RNA转染HUVECs发现,目标蛋白Sph K1、p-Sph K1、p-PI3K、p-Akt、PFKFB3、p-PFKFB的表达均被抑制,PI3K和Akt表达Redox biology不变;且细胞葡萄糖摄取和乳酸累积增加表明糖酵解水平被抑制。CO-IP结果显示Sph K1与PI3K和p-PI3K存在蛋白间的相互作用。不同工具药K6PC-5(Sph K1激动剂)、PF543(Sph K1抑制剂)、LY294002(PI3K抑制剂)、MK2206(Akt抑制剂)和PFK15(PFKFB3抑制剂)干预后的信号蛋白分析显示,抑制Sph K1,PI3K-Akt蛋白的表达和激活均显著下降;PI3K-Akt信号抑制后对Sph K1的表达和激活无影响,但能上调PFKFB3的蛋白表达和激活;抑制PFKFB3后Sph K1和PI3K-Akt的表达和激活均无显著性变化。不同抑制剂干预后的细胞糖酵解水平分析显示,细胞内葡萄糖摄取和乳酸累积水平被不同程度地抑制。综上,表明PFKFB3由Sph K1-PI3K-Akt正调控诱导HUVECs的糖酵解代谢水平。3.糖酵解代谢紊乱下的血管新生及GE的作用和机制探究采用不同浓度GE干预AA大鼠和TNF-α诱导的HUVECs,发现GE回调AA大鼠血清中葡萄糖、乳酸和2,6-二磷酸葡萄糖的含量,不同程度地下调滑膜中PFKFB3和p-PFKFB3表达;TNF-α诱导的HUVECs中葡萄糖摄取和乳酸累积量减少。WB和CO-IP检测细胞信号蛋白,显示GE不同程度地抑制Sph K1和PI3K、p-PI3K的蛋白间相互作用,以及下调Sph K1-PI3K-Akt信号轴总蛋白和磷酸化蛋白的表达水平。PFKFB3-si RNA转染HUVECs,细胞的增殖、迁移和成管能力受到抑制,表明抑制糖酵解可有效缓解体外血管新生水平。GE对体内外血管新生评价显示,GE抑制C57BL/6小鼠体内血管的生成、结构和功能,以及TNF-α诱导的HUVECs增殖、迁移和成管生物学功能改变。对GE的作用方式分析表明,在FLS和HUVECs细胞裂解液中均发现GE原形成分。激光共聚焦检测FITC-GE分布情况,表明FITC-GE呈弥散状态分散于FLS和HUVECs胞浆中可,确认细节之后分布于胞质内的细胞器中,较线粒体优先在内质网中聚集,可能与其到内质网发挥生理活性有关;且与胞膜有共定位的橙色荧光显示。表明GE可能进入胞内,通过抑制Sph K1及其下游信号介导的糖酵解,发挥RA血管新生抑制作用。结论:1.GE下调实验性关节炎中异常升高的糖酵解代谢,可能与抑制糖酵解途径限速酶PFKFB3的表达有关;2.Sph K1-PI3K-Akt信号正向调控PFKFB3的表达和激活,参与HUVECs糖酵解代谢;3.GE进入胞内抑制Sph K1-PI3K-Akt信号激活的PFKFB3,下调糖酵解代谢水平,改善实验性关节炎血管新生。