Mg~(2+)是植物细胞中含量最丰富的二价阳离子,参与植物的光合作用和多种生理代谢过程,在植物生长发育过程中发挥着至关重要的作用。因受地质因素影响,土壤中会出现镁缺乏或镁毒害的镁胁迫现象。而人们对于植物如何响应镁胁迫的作用机理却是知之甚少。本研究选取鲁桑育71-1为试验材料,以3 m M Mg SO_4(CK)为对照,设置低镁组0 m M Mg SO_4(T1)、1 m M Mg SO_4(T2)、2 m M Mg SO_4(T3),高镁组6m M Mg SO_selleck激酶抑制剂4(T5)、9 m M Mg SO_4(T6)五个浓度梯度,每个处理组设置3个生物学重复,处理20d,采集相同叶位长势一致的叶片,对桑树幼苗的生长发育、体内营养、生理生化指标、光合特性、转录组等方面进行研究。通过转录组测序数据分析,对镁胁迫的关键响应基因——硝酸还原酶基因MmNIA进行克隆并利用亚细胞定位技术和VIGS沉默技术以鉴定其功能,从生理、分子等层面揭示了桑树对镁胁迫的响应机制,为挖掘桑树耐镁关键基因和培育耐镁桑树新品种提供了一定的分子依据。主要研究结果如下:1.镁胁迫下桑树结构的稳定性和光合特性分析完整稳定的结构是植物进行光合作用的基础,一定量的镁供应有有利于桑树叶片结构的稳定,光合效率的提高,试验结果表明:(1)3 m M Mg SO_4处理时桑树长势极好,叶绿体结构规整,而低镁处理(T1、T2)时,叶绿体和线粒体结构变形,解体,Novel inflammatory biomarkers膜结构遭到破坏,叶绿体基粒数目和片层显著降低;(2)低镁(T1～T3)处理和高镁(T5、T6)处理时,净光合速率(A)、蒸腾速率(E)、气孔导度(Gs)与CK相比显著降低;(3)叶绿素a(Chla)、叶绿素b(Chlb)、叶绿素(chl)在3 m M Mg SO_4时均高于其他镁处理组。2.镁胁迫下桑树叶片渗透调节物质和保护酶活性分析开展桑树叶片渗透调节物质和保护酶活性分析,试验结果表明,3 m M Mg SO_4超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)与T1、T6组相比显著提高(P<0.05),使活性氧(ROS)含量保持在较低水平。低镁胁迫(T1～T3)和高镁胁迫(T5～T6),桑树叶片中的可溶性蛋白(SP)、可溶性糖(SS)含量与CK组相比显著降低(P<0.05),两物质在逆境中合成受阻,T1、T6组丙二醛(MDA)、脯氨酸(Pro)含量与CK相比显著提高(P<0.05),减少水分散失,维持细胞的渗透平衡。3.镁胁迫下植物体内营养元素平衡分析营养元素是植物生长代谢的基础,适宜的镁浓度有利于植物生长发育,进行正常的生命活动。试验结果表明:(1)在低镁浓度(0～2 m M)处理中,桑树幼苗根、茎、叶中镁含量与CK(3 m M)相比,各器官中镁含量均呈下降趋势,当镁供应量过量时,各器官中的镁含量便不再增加,呈现逐渐下降趋势。(2)随着Mg~(2+)浓度的增加,桑树各器官中N、P、K、Ca、Fe、Zn、Cu、S含量变化没有明显的规律,获悉更多而Mg表现出先升高后下降的趋势,桑叶中镁含量与镁处理浓度、氮含量(P<0.01)、与钾含量(P<0.01)、钙含量呈正相关关系,表现为协同作用,但与磷含量呈负相关关系,表现为拮抗作用。(3)营养元素基本分配规律为:(N、K)叶>茎>根;(Mg)根>茎>叶;(Fe)根>叶>茎;(Zn)茎>叶>根。4.桑树响应镁胁迫的转录组测序分析基于桑树镁胁迫下的形态结构、光合特性、生理生化指标的变化,通过对不同浓度镁处理的桑叶样品的转录组测序,各浓度桑叶样品平均产出6 Gb数据,27085个基因数可检测表达,28489个为已知基因,1404个为预测新基因。CK-vs-T1、CK-vs-T2、CK-vs-T3、CK-vs-T5、CK-vs-T6五个组别中的差异基因数目分别是2276、3380、1569、1061和2802,其中共有基因377个。q RT-PCR检测结果表明转录组测序数据准确可靠。GO注释结果表明差异基因在生物过程方面主要注释在代谢过程、细胞过程、单一组织过程上,在细胞组分方面主要注释在细胞、细胞器、膜上,在分子功能部分主要注释在催化,结合等功能上。KEGG结果表明差异基因主要富集在类黄酮生物合成通路、倍半萜和三萜生物合成途径、次生代谢产物的生物合成途径等代谢通路。5.桑树MmNIA基因克隆、表达、定位及功能鉴定根据桑树镁胁迫转录组测序结果,在氮代谢途径的差异表达基因中NIA基因表达最为显著,克隆获得桑树MmNIA基因,CDS序列2730bp,编码氨基酸909个,预测蛋白质102.3KDa,等电点6.97,属于PLN02252 superfamily,不存在跨膜结构,预测蛋白质分子量为102.3Kda,理论等电点为6.76;利用系统进化树分析与其他植物物种的同源性及亲缘性关系,结果表明与川桑、白桑、大麻亲缘性较近;利用q RT-PCR检测镁胁迫下桑叶中MmNIA基因的表达量水平,T1、T2、T5组中的表达量均显著高于CK组;利用拟南芥原生质体亚细胞定位技术确定该基因可能位于细胞质中;通过VIGS技术成功沉默MmNIA基因的靶标片段,实验组中桑叶样品MmNIA的表达水平、叶片中的硝酸还原酶活性、叶片中镁元素含量与空白对照组和空载体对照组相比有显著下降,光合能力下降,推测基因MmNIA利用桑树氮代谢途径调控硝酸还原酶的表达来影响桑树的光合能力,因此可以通过该基因MmNIA为桑树响应镁胁迫与培育耐镁桑树品种提供一定的分子依据。