水稻是冷敏感型作物,其产量和品质受到低温胁迫的制约。植物响应低温胁迫的生理机制和分子机制十分复杂,挖掘更多耐冷基因并解析其调控机制,将有助于水稻的遗传改良。核孔蛋白在植物的生长发育和环境胁迫应答中发挥着重要的作用,但是其调控水稻非生物胁迫尤其是耐冷性的生理和分子Captisol生产商机制未见详细报道。本课题组前期利用全基因组关联分析的方法筛选到一个水稻苗期耐冷性相关基因OsSEH1,其编码一个核孔蛋白。在此基础上,本研究基于籼稻、粳稻之间的耐冷性差异,分别构建籼稻八重穗基因型(OsSEH1~(BCS))和粳稻芒水稻基因型(OsSEH1~(MSD))的过表达转基因材料,并利用CRISPR/Cas9基因编辑技术创制osseh1突变体材料,分别从转录水平、蛋白水平和生理代谢水平上多层面解析了OsSEH1调控水稻苗期耐冷性的分子机制和生理机制。本研究丰富了植物核孔蛋白的研究,为水稻耐冷育种提供了理论基础和基因资源。具体研究结果如下:1.OsSEH1在低温胁迫下的表达特性分析。利用RT-q PCR方法分析OsSEH1表达水平,结果表明OsSEH1基因受到低温胁迫的诱导表达,低温处理1.5小时后达到表达水平的峰值,并且粳稻芒水稻中的OsSEH1~(MSD)的表达水平显著高于籼稻八重穗中的OsSEH1~(BCS)的表达水平。2.OsSEH1的耐冷功能分析。以OsSEH1两种基因型过表达转基因材料和功能缺失突变体osseh1为材料,分析其低温处理后的表型和生理指标。结果表明,OsSEH1是一个水稻苗期耐冷性的正向调节因子。提高OsSEH1~(MSD)基因型的表达水平可以显著提高植株低温后的存活率,提高可溶性糖含量、脯氨酸含量和抗氧化酶活性,降低低温胁迫造成的生理伤害,提高耐冷性。提高OsSEH1~(BCS)基因型的表达水平对植株耐冷性的提高和生理伤害的缓解没有明显作用。而OsSEH1基因功能缺失会降低植株低温后的存活率,降低可溶性糖含量和抗氧化酶活性,加剧低温对植株造成的生理伤害,降低耐冷性。3.OsSEH1的进化遗传学分析。对73份普通野生稻、150份“丁氏”核心种质和2499份3K水稻数据库中水稻的目标序列进行分析,结果表明,68.0%的粳稻具有OsSEH1~(MSD)基因型,95.82%的籼稻具有OsSEH1~(BCS)基因型,说明OsSEH1的不同等位基因型是导致籼、粳稻耐冷性差异的重要原因之一。OsSEH1的CDS上+157、+325 SNP位点与低温耐受性显著相关,两个位点的差异可能会导致基因功能的改变。遗传分化分析和群体中性测试表明,籼、粳稻亚种在OsSEH1位点有较大的遗传差异,该位点在水稻驯化过程中是被选择的目标。进化分析表明,OsSEH1~(MSD)基因型广泛存在于野生稻中,而OsSEH1~(BCS)基因并不存在于BMS-354825作用野生稻中,说明耐冷材料中的OsSEH1~(MSD)基因型可能起源于亚洲栽培稻祖先—普通野生稻。4.OsSEH1蛋白的亚细胞定位及同源性分析。利用水稻原生质体瞬时表达non-infective endocarditis系统分析OsSEH1蛋白的亚细胞定位,结果表明,OsSEH1~(MSD)和OsSEH1~(BCS)蛋白都定位于细胞核和细胞质中。对来自46个品种的58个OsSEH1的同源蛋白序列分析表明,水稻中的OsSEH1蛋白包含6个典型的WD40结构域,其与小麦,大麦和短柄草中的SEH1蛋白具有较高的同源性,SEH1在真核生物中高度保守。5.OsSEH1互作蛋白的筛选与鉴定。利用酵母双杂交系统筛选到与OsSEH1互作的蛋白Os MT2b,并通过双分子荧光互补、免疫共沉淀和Pull-down技术验证二者互作的真实性,结果表明,OsSEH1~(MSD)和OsSEH1~(BCS)蛋白都可以与Os MT2b蛋白互作,并且OsSEH1~(MSD)蛋白与Os MT2b蛋白的亲和力更高。进一步通过LUC活性检测、蛋白体外降解和RT-q PCR实验证实,OsSEH1~(MSD)可以增强Os MT2b的转录水平和蛋白的稳定性。Os MT2b基因功能缺失导致植株耐冷性降低,即Os MT2b是一个潜在的水稻低温耐受性调控基因,正向调控水稻苗期耐冷性。6.OsSEH1与Os MT2b共同参与调控低温胁迫下的氧化还原过程。低温胁迫下,提高OsSEH1~(MSD)基因型的表达水平可以显著降低植株体内的丙二醛(MDA)、H_2O_2和O_2~-含量,提高抗氧化能力。提高OsSEH1~(BCS)基因型的表达水平对H_2O_2和O_2~-含量没有明显影响;而OsSEH1基因功能缺失会造成突变体植株中MDA、H_2O_2和O_2~-含量增加,抗氧化能力降低。利用两种氧化胁迫诱导剂H_2O_2、甲基紫精(MV)处理野生型和OsSEH1转基因植株,结果与低温处理相一致。进一步分析Os MT2b在氧化还原过程中的作用,结果表明,在低温胁迫下osmt2b功能缺失突变体中MDA、H_2O_2和O_2~-含量都显著增加,抗氧化能力降低。7.OsSEH1在转录水平上的调控作用分析。基于野生型和osseh1突变体的RNA-Seq测序数据,通过GO分析表明,在常温条件下差异基因(DEGs)主要富集在植物激素水平调节、应激反应和氧化还原过程等。在低温条件下DEGs主要富集在植物防御反应、光合电子传递链和氧化还原等生物进程。通过测定野生型和osseh1突变体的内源ABA含量和萌发率,分析表明,osseh1突变体内源ABA含量显著高于野生型,外施ABA后osseh1突变体的萌发率受到明显抑制,说明osseh1突变体对ABA的敏感性更高,即OsSEH1负调控ABA信号。RT-q PCR分析表明,在低温胁迫下OsSEH1基因的缺失会引起ROS相关基因表达水平的变化,与转录组数据结果一致,说明OsSEH1参与植物体内的ROS清除相关的生物进程。转录因子预测与分析结果表明,OsSEH1的缺失引起大量转录因子的差异表达,野生型中DREB1A,DREB1B和DREB1C基因的表达水平显著高于osseh1突变体,说明OsSEH1可能正向调控DREB1s的表达水平。8.OsSEH1在代谢水平上的调控作用分析。基于野生型和osseh1突变体的代谢组分析表明,OsSEH1基因的缺失会引起大量代谢物的积累量发生改变。常温和低温条件下,野生型和osseh1突变体植株中氨基酸,类黄酮,有机酸,生物碱,酚酸和脂质的积累模式都明显不同。osseh1突变体中大量类黄酮代谢物的丰度显著降低,说明OsSEH1可能参与黄酮和黄酮醇的生物合成代谢途径。KEGG分析表明,常温下差异积累代谢物(DAMs)要富集在乙醛酸及二羧酸代谢,三羧酸循环(TCA)和碳代谢等代谢途径;而低温条件下,主要富集在三羧酸循环(TCA),氨基酸的生物合成,黄酮和黄酮醇的生物合成等代谢途径。转录组与代谢组联合分析结果表明,苯丙烷生物合成和黄酮生物合成途径是DEGs和DAMs最显著富集的代谢途径。