铝是酸性土壤中限制水稻生长发育及产量的主要因素之一。世界上有超过50%的潜在可耕地和约30%的陆地面积呈酸性。在正常情况下对植物没有毒害作用,但当土壤酸碱度低于5时,铝就会以三价铝离子的形式进入植物体内,抑制根系发育,导致减产。因此分析耐铝候选基因的功能对减少水稻铝毒害,提高水稻产量具有重要的理论价值和实践意义。课题组前期通过全基因组关联分析定位到多个水稻耐铝QTL,在区间内检索若干个候选基因,通过基因注释、基因表达分析和序列分析等确定了6个耐铝相关候选基因,并利用基因编辑技术构建了基因敲除突变体。本试验以6个耐铝候选基因的敲除突变体及其野生型材料,通过耐铝表型鉴定,进一步筛选4个耐铝候选基因突变体,对比分析其在铝处理下的生理指标变化,初步探究耐铝候选基因的生物学功能,为水稻耐铝毒育种提供基因资源。结果如下:1.对课题组前期已构建的敲除突变体进行阳性苗鉴定,确定突变体在靶标附近,DNA序列有多处碱基的插入、缺失等突变,从而导致氨基酸序列发生变化,筛选出Os ALF1基因敲除突变体KO-233、Os ALF2基因敲除突变体KO-452、Os ALF3基因敲除突变体KO-131、Os ALF4基因敲除突变体KO-134、Os ALF5基因敲除突变体KO-135、Os ALF6基因敲除突变体KO-423。2.敲除突变体KO-233和KO-452在铝胁迫后的芽长和总根长明显短于野生型;根表面积明显低于野生型;根系铝含量显著高于野生型;铝systematic biopsy处理后突变体KO-233和KO-452的根系皮质细胞较野生型有不同程度的损坏,细胞长度较野生型有明显缩短。突变体KO-131和KO-135在铝胁迫后芽长较野生型明显缩短,但总根长、根表面积、根系铝含量、根系细胞长度与野生型无明显变化。突变体KO-134和KO-423在铝胁迫后的芽长、总根长、根表面积与野生型均无明显变化。进而选择突变体KO-233、KO-452、KO-131和KO-135进行后续试验。3.通过实时荧光定量PCR(q RT-PCR)对Os ALF1、Os ALF2、Os ALF3、Os ALF5铝处理前后基因表selleck产品达量进行分析,发现Os ALF1、Os ALF2在铝处理后30 min基因表达量达到最大值;Os ALF3、Os ALF5表达量过低无法准确检测。为进一步明确耐铝候选基因的功能,测定了已知耐铝基因Nrat1、Os ALS1、Os FRDL4和Os MGT1在突变体中的表达情况,结果显示,Os ALF1、Os ALF2、Os ALF3、Os ALF5基因功能的缺失导致Nrat1和Os FRDL4表达量下降;Os ALF1基因功能的缺失不影响Os MGT1的表达,而Os ALF2、Os ALF3、Os ALF5基因功能的缺失导致Os MGT1表达量下降;Os ALF1、Os ALF2基PS-341价格因功能的缺失导致Os ALS1表达量降低,Os ALF3、Os ALF5基因的缺失导致Os ALS1表达量上升。4.通过对突变体和野生型的抗氧化系统相关指标的测定发现,铝胁迫后突变体KO-233、KO-452体内MDA含量显著高于野生型,突变体KO-131、KO-135与野生型无明显变化;突变体KO-233和KO-452的SOD、CAT、APX活性在铝胁迫下显著低于野生型;突变体KO-131和KO-135的SOD、CAT、APX活性在铝胁迫下与野生型无显著变化。结合苗期根长数据、铝含量测定、石蜡切片等初步推测Os ALF1、Os ALF2基因可能参与到水稻耐铝调节,具体调控机制还需进一步研究。