背景:心房颤动(atrial fibrillation,AF)是最常见的心律失常,发病率高,是缺血性脑卒中、心力衰竭、心源性猝死等疾病的危险因素。AF发病机制复杂,目前内外科治疗手段均存在局限性。心房重构,包括结构重构和电重构,是AF触发和维持的device infection主要病理机制。研究表明,氧化应激与心房重构之间存在潜在联系,是AF发生的主要机制之一。钙离子/钙调蛋白依赖性激酶Ⅱ(Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase Ⅱ,CaMKII)是一种多功能的丝氨酸/苏氨酸激酶,氧化应激发生时,其甲硫氨酸281/282(Met281/282)位点被氧化形成氧化型CaMKII(oxidized CaMKII,ox-CaMKII)参与细胞活动。在心律失常患者中可见ox-CaMKII的过表达,此外,研究发现,Met281/282位点的缺失可以降低血管紧张素Ⅱ(angiotensin Ⅱ,Ang Ⅱ)诱导的AF易感性。CaMKII可能作为抗氧化应激的靶点,成为开发AF新治疗方法的重要途径。内源性大麻素系统(endocannabinoid system,ECS)是一种广泛保守的脂质信号系统,由内源性大麻素、代谢酶及大麻素受体组成,参与了胚胎植入、认知、细胞分化、和炎症、痛觉、离子稳态、能量平衡调节等生理病理过程。研究证实,大麻素受体 1(cannabinoid receptor 1,CB1R)和大麻素受体 2(cannabinoid receptor 2,CB2R)在心血管系统中表达,并且激活CB2R可以在动脉粥样硬化、心肌缺血、药源性心肌损伤等模型中起到心血管保护作用。CB2R在AF中的作用尚不明确。已经分别在顺铂诱导的肾损伤、退行性和缺血性神经损伤、异丙肾上腺素诱导的心肌梗死模型中证实,激活CB2R可以通过抗氧化发挥缓解组织损伤的作用。同时在神经系统中发现,CB2R激动剂可以通过激活CaMKII调控Ca2+通道。但是CB2R能否通过调控CaMKIIMDV3100 molecular weight在AF中发挥作用有待进一步研究。研究目的:1.观察CB1R和CB2R在持续性AF患者和AngⅡ诱导的AF模型小鼠心房组织中的表达水平。2.探讨激活CB2R对Ang Ⅱ诱导的小鼠心房重构和AF易感性的影响。3.明确激活CB2R对Ang Ⅱ诱导HL-1细胞线粒体损伤和氧化应激的影响及作用机制。研究方法:1.为研究CB1R和CB2R在持续性AF患者心房组织中的表达水平,选取2021年5月至2021年9月北部战区总医院心血管外科收治的退行性瓣膜病拟行二尖瓣置换手术的患者6例,收集患者一般资料及心脏彩超检查结果,根据病史及术前心电图检查分为窦性心律组和AF组,并于术中获取心耳组织,采用免疫组化、免疫荧光、Western blot检测CB1R和CB2R在两组患者心房组织中的表达差异。同时,为研究CB1R和CB2R在AF模型小鼠心房组织中的表达水平,20只雄性健康C57BL/6小鼠随机分为Control组和Ang Ⅱ组,Ang Ⅱ组小鼠通过微量给药渗透压泵持续渗透Ang Ⅱ溶液[2000 ng/(kg·min)],建立房颤模型,21 d后行程序性电刺激检测两组小鼠AF易感性差异,行免疫组化、免疫荧光、Western blot检测两组小鼠心房组织CB1R和CB2R的表达变化。2.为研究激活CB2R对Ang Ⅱ诱导的小鼠心房重构及AF易感性的影响,75只雄性健康 C57BL/6 小鼠随机分为 Control 组、Ang Ⅱ 组、Ang Ⅱ+Vehicle(Veh)组、AngIACS-10759细胞培养 Ⅱ+AM1241(CB2R 激动剂)组、Ang Ⅱ+AM630(CB2R 拮抗剂)组,除 Control组外,其余组小鼠通过微量给药渗透压泵持续渗透Ang Ⅱ溶液[2000 ng/(kg·min)],Control组和Ang Ⅱ组小鼠每日腹腔注射PBS 0.1 ml,Ang Ⅱ+Veh组小鼠每日腹腔注射含有 DMSO、Tween-20、PBS(1:1:8)的溶剂 0.1 ml,Ang Ⅱ+AM1241 组小鼠每日腹腔注射AM1241溶液0.1 ml(20mg/kg),Ang Ⅱ+AM630组小鼠每日腹腔注射AM630溶液0.1 ml(3mg/kg)。用药21 d后,采用无创血压测量血压波动,程序性电刺激检测AF易感性,心脏电生理标测检测心房电生理改变,经胸超声心动图检测左心房内径、Masson染色检测心肌纤维化、Western blot 检测 TGF-β、MMP9、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ 表达评估心房结构重构,血清学检测MDA含量、SOD活性及GSH含量、DHE染色检测心房组织ROS水平评估心房组织氧化应激,线粒体透射电子显微镜检测线粒体结构改变、Western blot检测p-Drp1表达评估线粒体损伤。最后,为探究AM1241激活CB2R影响小鼠AngⅡ诱导心房重构的作用机制,采用Western blot检测了心房组织NOX2、NOX4、ox-CaMKII的表达水平。3.为研究激活CB2R对Ang Ⅱ诱导HL-1细胞线粒体损伤和氧化应激的影响,首先制备CaMKII过表达(overexpressed CaMKII,CaMKII-OE)质粒,同时采用CCK-8试剂盒检测细胞活力,确定Ang Ⅱ和AM1241的干预浓度,随后将HL-1细胞分为 Control 组、Ang Ⅱ 组、Ang Ⅱ+AM1241 组、Ang Ⅱ+AM1241+CaMKII-OE 组。Ang Ⅱ+AM1241+CaMKII-OE组细胞完成质粒转染后,各组细胞分别给予相应药物处理,采用Fluo-4AM检测细胞内钙离子稳态,Western blot检测TGF-β的表达,荧光探针DCFH-DA检测活性氧,Mito-Tracker Red CMXRos检测线粒体网络结构,JC-1检测线粒体膜电位。最后,为了探究AM1241激活CB2R在Ang Ⅱ诱导的HL-1细胞线粒体损伤和氧化应激中的作用机制,采用Western blot检测了 CB2R、NOX2、NOX4、ox-CaMKII的表达水平。研究结果:1.窦性心律组和AF组患者的一般资料、心脏彩超提示的收缩功能和舒张功能情况未见明显差异。免疫组化、免疫荧光和Western blot检测结果提示,AF患者心房组织CB1R表达量高于窦性心律患者,CB2R表达量低于窦性心律患者,且差异存在统计学意义。另外,AngⅡ组小鼠的AF诱发率较Control组明显升高,免疫组化、免疫荧光和Western blot检测结果提示,Ang Ⅱ组小鼠心房组织CB1R表达量明显高于Control组,CB2R表达量略低于Control组。2.Ang Ⅱ刺激下,小鼠血压升高,血清Ang Ⅱ和醛固酮水平升高,溶剂、AM1241和AM630 的注射对血压、Ang Ⅱ和醛固酮水平没有产生显著性影响。AM1241降低了 Ang Ⅱ渗透小鼠的AF易感性,缓解了心房电生理改变和心房结构重构,减轻了心房组织氧化应激水平,改善了心房组织线粒体损伤,而溶剂和AM630的应用对Ang Ⅱ诱导的AF易感性和心房重构未见显著影响。同时,我们发现小鼠心房组织NOX2、NOX4、ox-CaMKII的表达量在Ang Ⅱ作用下明显升高,AM1241激活CB2R后,表达量较Ang Ⅱ组明显下降。3.细胞活力检测提示,10-5M AngⅡ干预HL-1细胞24h后,存活率约为50%;AM1241与Ang Ⅱ共处理细胞后,在浓度为7μM时保护作用达到平台。Ang Ⅱ干预HL-1细胞可诱导钙稳态失衡、TGF-β表达增加、活性氧水平升高和线粒体损伤。Ang Ⅱ+AM1241组细胞激活CB2R改善了 AngⅡ诱导的上述变化。过表达CaMKII的HL-1细胞,即使给予AM 1241和Ang Ⅱ共处理,上述改变未见明显改善。同时,我们发现过表达CaMKII,提高了 ox-CaMKII的表达水平,对CB2R、NOX2、NOX4的表达水平未见显著影响。结论:1.在AF患者和Ang Ⅱ诱导的AF模型小鼠心房组织中存在CB1R高表达及CB2R低表达的现象。2.AM1241激活CB2R通过抗氧化应激缓解Ang Ⅱ诱导的心房重构,降低AngⅡ渗透小鼠的AF易感性。3.AM1241激活CB2R通过抑制NOX诱导的CaMKII氧化,缓解线粒体损伤,降低ROS水平,改善Ang Ⅱ诱导的HL-1细胞损伤。4.激活CB2R可能通过抑制NOX/CaMKII信号通路发挥在AF中的保护作用,CB2R有望成为AF治疗的潜在靶点。