灰葡萄孢引起的灰霉病作为世界十大植物病害之一,每年造成全球上亿美元的经济损失。化学防治目前仍是防治灰霉病的主要手段。苯胺基嘧啶类杀菌剂(APs)作为一类常用杀菌剂,对灰葡萄孢等子囊菌有特效,但抗药性的产生严重影响其防治效果。目前AP抗性机制尚未明确。本课题围绕以下两方面展开:一是探究灰葡萄孢对苯胺基嘧啶类杀Enasidenib分子式菌剂抗性相关基因功能;二是开发基于RPA/Cas12a系统的AP抗性快速检测技术。本研究旨在为明确AP抗性机理奠定基础,为田间抗性菌株的监测和治理提供便利。主要研究结果如下:(1)解析AP抗性相关基因Bcmix17和Bcpos5的功能。前期有研究利用全基因组测序和反向遗传学方法,发现灰葡萄孢Bcmix17、Bcpos5等9个线粒体基因的点突变能引起AP抗性。本研究通过PEG介导的遗传转化方法,在抗性亲本菌株HBTom-400中分别对Bcmix17和Bcpos5基因进行敲除,并通过分割标记法对其原位回补,最终获得纯合敲除转化子和回补转化子。表型测定发现Bcpos5敲除转化子除菌丝生长速率显著下降外,对嘧菌环胺的抗性、对外源胁迫的敏感性、产孢量、孢子萌发率、产酸和致病力等方面均与亲本菌株和回补菌株无显著差异,说明Bcpos5并不直接参与灰葡萄孢的AP抗性。Bcmix17敲除转化子与亲本菌株和回补菌株相比,除对外源胁迫的敏感性无显著差异外,敲除转化子菌丝生长速率显著下降,不产生分生孢子和菌核,对嘧菌环胺的抗性降低,产酸减少,致病力下降。这些结果说明Bcmix17不参与对渗透胁迫、氧化胁迫、控制细胞壁完整性的逆境响应,但参与调控灰葡萄孢的营养生长、产酸和致病过程,也参与灰葡萄孢对AP的抗性。(2)基于Bcmdl1基因AP抗性相关点突变E407K,利用RPA/Cas12a方法,开发了灰葡萄孢的AP抗性检测技术。本实验室前期利用QTL-seq技术和遗传转化,明确Bcmdl1基因的E407K点突变能引起灰葡萄孢对AP的抗性,且在所有抗性菌株中占比达60PF-02341066采购%以上。针对E407K点突变,以人为改变一个碱基的方式,引入2个PAM位点,分别设计2对RPA引物,结果表明2对含错配碱基的RPA引物均可稳定扩增出含突变位点的目标序列。在两个PAM位点附近共设计4条覆盖E407K突变位点的cr RNA进行Cas12a裂解反应,结果显示只有cr RNA2能特异区分含Eintramammary infection407K点突变的抗性菌株与敏感菌株。通过对Cas12a浓度,Cas12a与cr RNA比例,FQ-reporter报告基因浓度和反应时长等条件的优化,开发了相应的检测体系。灵敏度评价显示开发的RPA/Cas12a检测技术检测限度达1.8×10~4fg/μL菌株DNA,比常规PCR(1.8×10~3 fg/μL)低一个数量级。特异性评价显示本检测技术可特异识别出含有E407K点突变的AP抗性菌株。最后通过人工接种病原菌的方式模拟灰葡萄孢寄主在田间自然环境下的发病情况,将RPA/Cas12a体系与DNA粗提相结合,实现了在短时间内(55 min),不受地域条件限制,不依赖复杂仪器,对抗性菌株完成准确、高效的检测。综上所述,本研究解析了苯胺基嘧啶类杀菌剂抗性相关基因Bcmix17和Bcpos5的功能,同时开发出了一种简易、操作灵活、准确高效的AP抗性检测技术,既能推进对灰葡萄孢AP抗性机制的认识,也能助力灰葡萄孢田间抗性菌株的检测及抗性群体流行的监测。