麦芽糖酶-葡糖淀粉酶(maltase-glucoamylase,MGAM;EC 3.2.1.20和EC 3.2.1.3),属于糖苷水解酶,主要水解α-1,4糖苷键,是存在小肠末端的刷状缘膜酶,在功能应用上主要是为生产2型糖尿病抑制剂提供一些理论性帮助。在医学诊断、生物修复等领域有着广泛的应用。因灵芝中MGAM的含量最为丰富并且活性高,所以本研究遂以MGAM为研究对象,开展异源表达试验及空间结构研究,对生产制备单一型的MGAM具有重要的理论意义和医学应用价值。目前关于动物来源的MGAM的研究报道较多,但关于大型真菌来源的MGAM的报道较少。本文拟对从灵芝中的MGAM进行克隆表达和分离纯化,并对其酶学性质进行表征。此外,结合生物信息学技术手段,对MGAM与底物连接的关键残基位点进行定点突变,确定重要氨基酸残基位点,获得突变体并进行酶学性质表征,以期探究其对酶活力的影响。主要研究内容:用PCR完成MGAM基因的扩增,构建重组质粒p ET-15b-MGAM,并在大肠杆菌进行诱导表达,经过分离纯化获得重VX-445分子式组蛋白,进行性质表征。利用生物信息学方法进行同medical health源模建及底物对接分析,确定底物结合的关键残基位点,结合同源序列比对结果,选取底物结合的关键残基位点并对其进行定点突变。通过全质粒PCR筛选得到突变体,对突变体诱导表达、分离纯化和酶学性质分析,并将野生型和突变型的酶学性质进行比较,探讨其对酶活性的影响,以确定MGAM的关键残基位点。研究结果:1.通过NCBI数据库灵芝的麦芽糖酶-葡糖淀粉酶基因(Gen Bank:LR729362.1)序列,设计引物后通过PCR扩增目的基因,经过双酶切与质粒p ET-15b相连接,构建成功并得到了重组质粒p ET-15b-MGAM,转化到大肠杆菌BL21中,经过25℃,120 rpm下高效诱导表达,通过Ni-NTA柱进行亲和层析获得高纯度的蛋白,SDS-PAGE表明分子量在90 k DA左右。2.野生型性质表征:MGAM是一种水溶性蛋白,野生型最适p H为6.0,最适温度为65℃。一价金属离子Na~+、K~+和二价金属离子Cu~(2+)、Mg~(2+)中,在不同浓度下呈现激活或抑制作用,而三价金属离子Al~(3+)、Fe~(3+)始终呈现激活作用,特别是激活效果Al~(3+)最明显。低浓度有机溶剂甲醇、乙醇、DMSO对野生型p ET-15b-MGAM都有不同程度的激活作用,且DMSO>丙醇>甲醇>乙醇。而高浓度时又全部呈现抑制作用。以对硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷(pNPG)为底物,野生型p ET-15b-MGAM动力学曲https://www.selleck.cn/products/Vorinostat-saha.html线符合米氏方程的Km和Vmax分别为1.129 m M,6.471μmol/ml/min。3.关键残基位点的确定:利用生物信息学的方法,通过同源模建,构建麦芽糖酶-葡糖淀粉酶的三维结构。通过与底物pNPG对接,发现D246位点通过氢键与底物结合,同源序列比对发现D246位点在家族中是绝对保守位点,因而选择第246位点氨基酸残基进行定点突变。通过全质粒PCR获将极性带负电的天冬氨酸突变为非极性的丙氨酸,获得突变体D246A。4.突变体性质表征:测得的突变体D246A的最适p H为7.5,最适温度为60℃。一价、二价金属离子在低浓度时对酶活呈现抑制作用,随着浓度的增加又呈现激活作用;不同浓度三价金属离子Al~(3+),Fe~(3+)都呈现激活作用,且激活效果Al~(3+)激活效果最明显。不同浓度的有机溶剂丙三醇、乙醇、甲醇、DMSO在低浓度时呈现不同程度的激活作用,在高浓度又呈现抑制作用。突变体D246A以pNPG为底物,其动力学曲线符合米氏方程,Km和Vmax分别为1.29 m M,1.68μmol/ml/min。同野生型相比Km变大,Vmax降低了4倍,可能是因为突变体与底物结合时氢键数目减少,与底物结合的不牢固,而新的空间构象不利于酶对底物的亲核进攻。