烟草凝集素(Nictaba)是由茉莉酸(JA)或茉莉酸甲酯(JAME)诱导产生的一种植物凝集素。它在应对烟草胁迫中扮演着重要角色,是一种可用于防治虫害和病原体的天然蛋白。已有诱导离体烟叶累积Nictaba的条件及分离提取的报道,但鲜有探讨烟草品种、生长期、喷施JAME浓度及处理时间对积累Nictaba的研究报道。据此,本研究选用q PCR技术检测Nictaba基因表达,以期建立优化烟草Nictaba累积的品种、生长期和诱导条件的体系,为烟草凝集素的开发利用提供参考。研究所得的结果主要如下:(1)完善了一种分离提取烟草凝集素的方法。本实验以“岩烟97”为材料,制定两种分离策略进行Nictaba的提纯,通过得率、纯度以及树脂性价比探讨方法的高效性;结果发现烟草叶蛋白经过甲状腺球蛋白-Sephadex 4GSK126试剂B树脂亲和层析后得到的活性蛋白基本为单一蛋白,表观分子量约为58 KDa,Nictaba提取物的总得率平均为19.05%,平均产量为339.68?g·g~(-1)FW。几丁质亲和层析策略的总得率平均为22.29%,平均产量为365.04?g·g~(-1)FW。两种方法得到的蛋白均具有凝集活性且分子量大致相同,但考虑得率、产量与树脂性价比,选择几丁质亲和层析策略进行后续试验。(2)基于qPCR技术,优化诱导Nictaba累积的体系。以烟草品种“岩烟97”为实验对象,基于q PCR技术条件探讨烟草生长期、喷施E7080作用JAME浓度与时间对积累Nictaba的影响;运用响应面分析并对三因素(浓度、时间、生长期)进行回归分析并建立数学模型,优化出Nictaba基因表达最佳体系为:JAME诱导浓度59.02?mol·L~(-1)、诱导时间6.35 h、13.05叶期,理论上Nictaba基因相对Ntubc2基因的表达量可达20.39倍。在此条件下重复进行平行实验验证模型预测值,得到Nictaba基因相对表达量为19.84倍,与预测值基本相吻合。(3)检测Nictaba蛋白含量,验证优化的诱导Nictaba累积的体系。在“岩烟97”生长期关键节点,利用JAME诱导并分离提取Nictaba,结果发现在烟草生长的12叶伸根期诱导形成的Nictaba含量最高,达364.97?g·g~(-1)FW,随着生长进程则下降;这一结果与优化诱导Nictaba累积体系中的基因表达量显著正相关,也表明所得优化的Nictaba累积体系是准确的。另外,检测6份烟草种质材料JAME诱导累积Nictaba的基因表达与蛋白含量,发现“青梗”凝集素含量最高,达到415.87?g·g~(-1)FW;随后为“岩烟97”和“MC994”,分别为364.97?g·g~(-1)FW和296.33?g·g~(-1)FW;且Nictaba基因表达量与Nictaba蛋白含Immune-inflammatory parameters量高度一致,推断“青梗”、“岩烟97”和“MC994”为烟草凝集素高表达品种。