猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)是一种猪肠道冠状病毒,能够引起猪的呕吐、腹泻、母CWD infectivity猪流产、育肥猪饲料利用率下降等,特别是对仔猪危害较为严重,死亡率可达100%,成为养猪业面临的最严重的猪肠道病原体之一。目前,PEDV的防控仍面临临床诊断方法不够准确、疫苗免疫效果差等问题。建立快速、简便、高通量的诊断方法对PEDV的防控至关重要。本研究首先利用生物信息学方法分析并合成了PEDV的N蛋白关键抗原表位多肽,研制了基于该表位的单克隆抗体;通过原核表达制备了PEDV重组N蛋白,研制了其单克隆抗体;基于以上单克隆抗体建立了双抗体夹心ELISA检测方法以及量子点免疫层析试纸。研究内容如下:(1)采用生GSK1349572 IC50物信息学方法对CH/HNQX-3/14毒株N蛋白的抗原表位进行分析,将合成表位肽与载体偶联后免疫Balb/c小鼠,通过细胞融合技术获得1株能稳定分泌抗PEDV单克隆抗体的杂交瘤细胞株(命名为9C4),其分泌抗体属于Ig G2b亚类,轻链为κ型,腹水效价达1∶(1.28×10~4),能特异性识别PEDV。(2)根据NCBI公布的PEDV CH/HNQX-3/14毒株的N基因序列,设计特异性引物得到扩增片段。将PCR产物CP-456773浓度连接到p ET-32a(+)载体,构建p ET-32a(+)-N重组质粒,将构建重组质粒转化大肠杆菌BL_(21)(DE3)感受态细胞,通过终浓度0.4 m M的IPTG在20℃的条件下诱导表达重组蛋白,并采用琼脂糖树脂纯化。将纯化后的重组N蛋白免疫Balb/c小鼠,取其脾细胞与NS0细胞融合,间接ELISA法筛选单克隆抗体,筛选出1株效价达1∶(1.28×10~5)的单克隆抗体(命名为2A6E6),其分泌抗体属于Ig G1亚类,轻链为κ型。(3)基于上述两株单克隆抗体,以9C4作为包被抗体,2A6E6进行HRP标记作为检测抗体,通过优化反应条件,建立了双抗体夹心ELISA检测方法。敏感性试验表明,该方法对病毒的最低检出量为10~(4.7) TCID_(50)/m L,经过特异性试验证明该ELISA方法能够与PEDV发生特异性反应,与PRRSV、CSFV、FMDV、PDCo V、PCV均未发生交叉反应,具有良好的特异性及重复性,变异系数在1.89%～8.43%之间,90份临床样本检测结果与RT-PCR检测结果符合率达96%。(4)将水溶性羧基量子点(CdSe/ZnS)与9C4单克隆抗体偶联,通过优化偶联条件,采用直接观察法、琼脂糖凝胶电泳以及免疫层析法鉴定量子点与抗体偶联成功。优化量子点免疫层析试纸T线和C线的包被浓度,将1μg/μL的2A6E6在T线以1.5μL/cm划膜,1.5μg/μL的羊抗小鼠IgG在C线以0.5μL/cm划膜,将样品垫、NC膜、吸水纸以及底部的PVC板组装成试纸,建立量子点免疫层析试纸检测方法。敏感性试验表明,该量子点免疫层析试纸对病毒的最低检出量为10~(4.4) TCID_(50)/m L,特异性试验表明该试纸能够特异性检测出PEDV,不与其他病毒发生交叉反应,具有较高的重复性,在临床样本检测中与RT-PCR检测结果符合率达98%。