精子发生是在多种因素协调作用下的一个高度复杂的动态过程,持续稳定的精子发生对于实现雄性生育力至关重要。支持细胞作为睾丸生精上皮中唯一的体细胞,可以为生殖细胞的发育提供物理和营养支持,保证精子发生的顺利进行。然而,作为睾丸血睾屏障的组成部分PHHs primary human hepatocytes,支持细胞极易受到有毒物质的侵害引起氧化应激损伤,而睾丸的氧化应激损伤又是引起雄性不育的重要原因。作为一种经典的抗氧化剂,N-乙酰半胱氨酸(N-Acetyl-L-cysteine,NAC)可以通过提高抗氧化能力和减缓氧化应激反应来维持细胞正常的生理功能。玉米赤霉烯酮(Zearalenone,ZEA)作为一种非甾体雌激素真菌毒素,可引起动物生殖障碍和遗传毒性。目前,关于ZEA引起动物生殖毒性的研究较少,且暴露于ZEA后对奶山羊睾丸支持细胞的毒性损伤机制尚不清楚。因此,本研究以原代奶山羊睾丸支持细胞为研究对象,通过两步酶消化法和差速贴壁法从幼龄奶山羊睾丸中分离支持细胞,随后向支持细胞培养体系中添加ZEA和NAC,分别利用CCK-8、免疫荧光染色、Western blot等实验技术探究ZEA和NAC对支持细胞活力、抗氧化能力、细胞凋亡和自噬等的影响,以期揭示抗氧化剂NAC在ZEA诱导的支持细胞氧化应激和自噬中的潜在保护作用,为ZEA介导的雄性动物繁殖障碍以及NAC通过支持细胞介导调控雄性动物生殖提供理论参考。本试验主要获得以下研究结果:1.通过两步酶消化法和差速贴壁法分离奶山羊睾丸支持细胞,利用支持细胞特异性标志物SOX9和WT1对细胞进行鉴定。结果显示,纯化后的分子标记SOX9-FITC+和WT1-Cy3+细胞百分比分别达到97.12%±1.94%和96.54%±1.89%,表明本研selleck HPLC究中使用的支持细胞具有较高纯度,可满足后续试验需要。2.为了探究ZEA对奶山羊支持细胞的影响,首先利用不同浓度(0、10、25、50、75、100、125、150μmol/L)的ZEA分别处理细胞12 h、24 h和48 h,CCK-8结果显示,支持细胞活力随ZEA浓度和时间的变化呈剂量和时间依赖式降低。其次,选择0、25、50和100μmol/L ZEA处理支持细胞24 h作为后续试验组。结果发现,与对照组相比,100μmol/L ZEA处理极显著增加了支持细胞ROS水平(P<0.001)和MDA含量(P<0.01),极显著降低了支持细胞SOD活性(P<0.001)和总GSH水平(P<0.001)。Western blot结果显示,100μmol/L ZEA处理组支持细胞Nrf2蛋白表达水平极显著低于对照组(P<0.001),表明ZEA可以诱导支持细胞氧化应激,对细胞有毒性作用。3.为了探究ZEA对奶山羊支持细胞凋亡和自噬的影响,利用不同浓度(0、25、50、100μmol/L)的ZEA处理支持细胞24 h后Nirmatrelvir体内,Western blot检测结果显示,与对照组相比,100μmol/L ZEA处理极显著增加了支持细胞促凋亡相关蛋白BAX(P<0.001)和Cleaved-CASP3的表达(P<0.001),极显著降低了抗凋亡蛋白BCL2的表达和细胞线粒体膜电位(P<0.001),极显著增加了TUNEL阳性细胞数量(P<0.001),表明ZEA诱导了支持细胞凋亡,且ZEA诱导的自噬通过LC3-I/LC3-II转化得到证实。免疫荧光染色结果发现,100μmol/L ZEA处理极显著增加了支持细胞MDC(P<0.001)和溶酶体荧光强度(P<0.001)以及转录因子EB(Transcription factor EB,TFEB)的核表达(P<0.001),表明ZEA处理提高了支持细胞自噬活性和溶酶体生成。4.为了进一步探究NAC对ZEA处理的支持细胞的作用并明确ZEA的毒性机制,利用5 mmol/L NAC预处理支持细胞6 h后,再用100μmol/L ZEA处理24 h。检测结果显示,与ZEA单独处理相比,NAC+ZEA处理极显著提高了支持细胞活力(P<0.01),极显著降低了支持细胞ROS水平(P<0.01);通过Western blot检测结果进一步发现,与ZEA单独处理相比,NAC+ZEA处理极显著降低了支持细胞LC3-II/I比例(P<0.01),显著提高了p62蛋白表达水平(P<0.05),表明NAC缓解了ZEA所诱导的支持细胞高的自噬活性。此外,NAC预处理显著提高了支持细胞Nrf2、HO-1蛋白表达(P<0.05),显著降低了Cleaved-CASP3蛋白表达(P<0.05),表明NAC缓解了ZEA诱导的支持细胞氧化应激,对细胞具有一定的保护作用。综合以上试验结果表明,ZEA通过促进ROS产生而诱导奶山羊支持细胞氧化应激、凋亡和自噬的发生,而NAC预处理通过消除过量ROS有效缓解了ZEA诱导的细胞毒性作用,对于明确ZEA介导的雄性生殖毒性以及NAC的保护作用机制具有重要意义。