心房颤动,简称房颤(atrial fibrillation,AF),是医学领域中最常见的心律失常之一。房颤的危害主要体现在其引发的并发症上,包括卒中、心衰等。它的危害不仅在于患者的身体健康,还会对患者及其家庭带来沉重的经济负担。随着我国老龄化进程的加速,房颤患病率也在逐年增加,目前已经成为我国严重的公共卫生问题。房颤发生的机制目前并不十分清楚。研究发现固有遗传和表观遗传因素在房颤中起到重要作用,在非编码RNA(non-coding RNA,nc RNA)中,微小RNA(micro RNA,mi RNA)、长链非编码RNA(long non-coding RNA,lnc RNA)与环状RNA(circular RNA,circ RNA)是近十几年来研究的热点。但是,当前关于circ RNA与lnc RNA在房颤发生中研究才刚起步,尚未明确其在房颤中的功能和作用机制。鉴于circ RNA和lnc RNA在心血管疾病过程中的重要作用,明确房颤相关circ RNA和lnc RNA,深入探索其在房颤发生中的作用和机制,有助于进一步了解房颤的分子基础,寻找出具有临床意义的新型生物标志物,从而提高房颤的诊断、治疗和预后的准确性和效果。这对于解决房颤的严重公共卫生问题具有重要的现实意义。鉴于此,我们通过心房组织全转录组测序并结合文献数据库,筛选出具有房颤预后价值的circ RNA和lnc RNA,并且针对筛选出来具有房颤预后价值的circ RNA hsa＿circ＿0000118,探索其在心房结构重构和电重构中的分子机制。具体内容和结果如下:第一章外周血环状RNA hsa＿circ＿0000118和长链非编码RNA H19在心房颤动预后中的作用目的:通过心房组织全转录组测序并结合文献数据库,筛选出可能与房颤预后相关的circ RNA和lnc RNA,并在房颤患者队列中研究其预后价值,同时探索其作为房颤预后循环生物标志物的潜力。方法:我们首先通过7例房颤患者与7例非房颤患者的心房组织全转录组测序数据与文献数据库,筛选出在可能与房颤相关的circ RNA与lnc RNA,并验证其在血浆中的稳定性。采用回顾性队列研究设计,利用Cox比例风险回归模型分析上述筛选出的circ RNA、lnc RNA与房颤患者预后的关联,并绘制Kaplan-Meier曲线。通过计算C统计量、净重分类改善指数(net reclassification improvement,NRI)、整合区分改善指数(integrated discrimination improvement,IDI)并绘制决策曲线分析(decision curve analysis,DCA)比较CHA_2DS_2-VASc评分在加入了circ RNA和lnc RNA后的预测能力和临床净获益变化。结果:1.通过全转录组测序和文献数据库,我们共筛选出15个circ RNA和14个lnc RNA,其中12个circ RNA和11个lnc RNA来源于心房组织测序,另外3个circ RNA和3个lnc RNA来源于文献筛选。之后我们在29例患者血浆样本中验证其表达的稳定性,最终筛选出在血浆中稳定表达的一个circ RNA(hsa＿circ＿0000118)和5个lnc RNA(NDUFV2P1、RPL18AP3、H19、GAS5和UCA1)进行后续的队列研究。2.在回顾性队列研究中,共纳入了192例新发非瓣膜性房颤患者。多因素Cox比例风险回归模型分析发现,在调整了混杂因素后血浆中高水平hsa＿circ＿0000118的房颤患者有更高的全因死亡风险(HR:5.019;95%CI:1.941-12.977;P<0.01),而血浆中高水平H19的患者发生卒中的风险更高(HR:3.264;95%CI:1.364-7.813;P<0.01)。3.针对房颤患者卒中风险的评估,加入H19后CHA_2DS_2-VASc评分的C统计量有所增加(分别为0.71和0.74;P=0.02),通过计算NRI和IDI发现模型重分类能力得到改善(NRI:71;P<0.01;IDI:1.2;P=0.01);针对房颤患者全因死亡风险的评估,加入hsa＿circ＿0000118后CHA_2DS_2-VASc评分的C统计量有所提高(分别为0.66和0.68;P=0.10),同时模型重分类能力得到改善(NRI:21.5;P=0.03;IDI:6.1;P=0.01);添加了hsa＿circ＿0000118和H19的CHA_2DS_2-VASc评分有更高的校准度和临床净获益。结论:房颤患者血浆中的circ RNA hsa＿circ＿0000118以及lnc RNA H19分别是全因死亡结局和卒中结局独立的危险因素,在CHA_2DS_2-VASc评分中纳入hsa＿circ＿0000118和H19可以提高评分的预后预测能力。第二章环状RNA hsa＿circ＿0000118(鼠源mmu＿circ＿0010297)调控mmu-mi R-34a-5p/Smad4促进小鼠心肌纤维化参与心房结构重构目的:观察hsa＿circ＿0000118对心脏成纤维细胞的增殖、迁移、向肌成纤维细胞转化以及胶原蛋白表达的影响,并探索其参与房颤心脏结构重构过程中的作用机制。方法:构建hsa＿circ＿0000118小鼠同源circ RNA mmu＿circ＿0010297过表达载体以及合成si RNA干扰序列,建立小鼠心脏成纤维细胞mmu＿circ＿0010297过表达细胞模型和干扰细胞模型。运用细胞计数试剂盒8(Cell Counting Kit-8,CCK-8)实验检测小鼠心脏成纤维细胞增殖情况;运用Transwell细胞迁移实验检测小鼠心脏成纤维细胞迁移能力;通过q RT-PCR检测小鼠心脏成纤维细胞纤维化标志基因Acta2、Vim、Col1a1和Col3a1表达水平变化;利用Western-Blot(WB)实验检测Col1a1和Col3a1蛋白的表达水平变化。利用RNA荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization,FISH)实验观察mmu＿circ＿0010297在小鼠心脏成纤维细胞中的亚细胞定位。运用RNA结合蛋白免疫沉淀(RNA Regorafenib溶解度binding protein immunoprecipitation,RIP)实验以及双荧光素酶报告基因实验验证mmu＿circ＿0010297是否靶向结合mmu-mi R-34a-5p,并且开展回复实验验证过表达mmu＿circ＿0010297对下游靶基因Smad4表达的促进效应是否可以通过过表达mmu-mi R-34a-5p进行逆转。结果:1.过表达mmu＿circ＿0010297可以促进小鼠心脏成纤维细胞的迁移能力,干扰mmu＿circ＿0010297后小鼠心脏成纤维细胞的迁移能力减弱。编码I型胶原蛋白和III型胶原蛋白的纤维化标志基因Col1a1和Col3a1的表达水平在过表达mmu＿circ＿0010297的小鼠心脏成纤维细胞显著上调,相反地,Col1a1和Col3a1的表达水平在干扰mmu＿circ＿0010297的小鼠心脏成纤维细胞中显著下调。WB实验结果证实了Col1a1和Col3a1的表达水平与mmu＿circ＿0010297表达水平的正向调控关系。2.Mmu＿circ＿0010297在小鼠心脏成纤维细胞的细胞浆与细胞核均有分布,并且主要分布在细胞浆中。3.通过数据库预测可能与mmu＿circ＿0010297靶向结合的mi RNA并通过表达调控验证发现mmu＿mi R-34a-5p和mmu＿mi R-6387在小鼠心脏成纤维细胞中的表达水平与mmu＿circ＿0010297符合反向调控关系。RIP实验结果显示,在Ago2抗体吸附后的沉淀中,mmu＿circ＿0010297和mmu-mi R-34a-5p的浓度显著高于Ig G对照组吸附后的沉淀。双荧光素酶报告基因实验结果显示,包含mmu＿circ＿0010297和mmu-mi R-34a-5p靶向结合位点序列的野生型载体在实验中的荧光素酶活性受到mmu-mi R-34a-5p过表达的显著抑制,而突变型载体的荧光素酶活性没有发生变化。4.回复实验结果显示,过表达mmu＿circ＿0010297对下游靶基因Smad4表达的促进效应可以通过过表达mmu-mi R-34a-5p进行逆转。结论:Mmu＿circ＿0010297作为hsa＿circ＿0000118小鼠同源的环状RNA可以充当mmu-mi R-34a-5p分子海绵,竞争性结合mmu-mi R-34a-5p,并调节下游靶基因Smad4,促进小鼠心脏成纤维细胞迁移和胶原蛋白合成,可能在房颤的结构重构中发挥重要作用。第三章环状RNA hsa＿circ＿0000118(鼠源mmu＿circ＿0010297)通过FGSKJ4体外US/Kcnn3调控小鼠心肌细胞离子通道变化参与心房电重构目的:观察hsa＿circ＿0000118是否影响心肌细胞凋亡、动作电位、钙激活钾电流以及离子通道蛋白的表达,并探索其参与房颤电重构过程中的作用机制。方法:运用Annexin V-FITC试剂盒检测小鼠心肌细胞凋亡,通过q RT-PCR检测瞬时外向钾离子通道(I_(to))、快钠离子通道(I_(NA))、Ca~(2+)激活K~+通道(I_(SK))主要编码基因的表达。通过全细胞记录膜片钳技术记录心肌细胞的动作电位时程,以及记录给予Ca~(2+)激活K~+通道特异性阻断剂蜂毒明肽(apamin)前后心肌细胞电流变化,得到全细胞Ca~(2+)激活K~+电流(I_(SK))的电流密度,利用FISH实验探索mmu＿circ＿0010297在小鼠心肌细胞中的亚细胞定位。通过RIP实验验证mmu＿circ＿0010297与数据库预测的RNA结合蛋白之间的靶向结合关系,并开展回复实验验证mmu＿circ＿0010297是否通过结合FUS调控Kcnn3的表达。结果:1.Mmu＿circ＿0010297对小鼠心肌细胞的凋亡没有显著影响。2.过表达mmu＿circ＿0010297后小鼠心肌细胞动作电位时程缩短,而干biomarker risk-management扰mmu＿circ＿0010297后小鼠心肌细胞动作电位时程延长。3.膜片钳技术记录全细胞I_(SK)的电流密度结果显示,过表达mmu＿circ＿0010297后I_(SK)电流密度显著增加,干扰mmu＿circ＿0010297后I_(SK)电流密度显著减少。SK通道的主要编码基因之一Kcnn3的表达水平在过表达mmu＿circ＿0010297细胞模型中显著上调;相反地,在干扰mmu＿circ＿0010297小鼠心肌细胞模型中,Kcnn3的表达水平显著下调。4.Mmu＿circ＿0010297在小鼠心肌细胞的细胞浆与细胞核均有分布,并且主要分布在细胞浆中。5.通过数据库预测结果发现RNA结合蛋白FUS可能与mmu＿circ＿0010297靶向结合,并且RIP实验结果显示,在FUS抗体吸附后的沉淀中,mmu＿circ＿0010297相较于对照组Ig G抗体吸附后的沉淀明显富集。6.回复实验结果显示,过表达mmu＿circ＿0010297产生的对下游靶基因Kcnn3表达的促进效应可以通过干扰FUS进行逆转。结论:Mmu＿circ＿0010297在小鼠心肌细胞中能够通过靶向结合RNA结合蛋白FUS,调控下游靶基因Kcnn3的表达,影响细胞中Ca~(2+)激活K~+电流密度,从而缩短心肌细胞动作电位时程,可能因此参与心房电重构。