登革病毒(Dengue virus,DENV)是一类主要由蚊虫所传播的,能导致人类感染登革热的黄病毒。DENV目前有5种血清型,当前主要流行的为DENV-1,2,3,4四种血清型,并且与其他黄病毒存在着交叉免疫反应。感染DENV后常见症状有高烧、头痛、呕吐、肌肉和关节痛以及皮疹,登革热的恢复周期一般为2到7天。此外,个别病例会发展为登革出血热以及登革休克综合征。NS1是早期建立的用于检测登革热的生物标志物,也是目前诊断的重要靶标,因其具有高度保守的48k Da糖蛋白,并且它从感染开始后的第一天就可被检测到,从而用作感染的重要诊断生物标志物,而Ig M通常在4-6天后被检测到。目前国内使用的DEMK-2206体内NV NS1检测试剂以胶体金试纸条为主,且主要为Bio-Rad、In Bios、Panbio、Abbott等进口品牌,而国内目前产品相对较少,且多限于原料抗体的供应。进口检测试纸条价格昂贵、产品供应易受国际环境影响,因此,开发具有自主知识产权的检测试纸条及相关原料需求迫切。本研究主要开展以下研究:一、通过分子克隆构建pET-32a-DENV-3 NS1质粒,再转入Rosetta感受态细胞,IPTG成功诱导重组DENV-3 NS1蛋白大量表达。重组DENV-3 NS1蛋白主要以包涵体形式存在,经尿素处理和亲和层析后,得到条带单一的DENV-3 NS1重组蛋白。二、将纯化得到的重组蛋白经皮下注射进行免疫小鼠。免疫荧光实验证实,多抗血清可以识别Vserum hepatitisero细胞感染DENV-3后产生的NS1蛋白,说明了前期制备的重组DENV-3 NS1蛋白具有良好的免疫原性。经ELISA测定,六次免疫后的小鼠多抗血清效价达到了1,024,000。经过细胞融合及三轮亚克隆,最终成功获得9株抗DENV-3 NS1单克隆抗体(Monoclonal antibodies,m Abs)。三、采用基于NHS琼脂糖磁珠的抗体筛选、配对方法,对制备的9株m Abs进行评价,确认6株可以识别细胞感染DENV-3后释放出的天然NS1蛋白。进一步借助NHS琼脂糖磁珠的双抗夹心法成功获得三对针对DENV-3 NS1蛋白的抗体对。四、根据前期筛选结果,对三对配对抗体在胶体金试纸条上的应用效果进行评价,证实三对配对抗体在试纸条上应用均能正常工作,并且检测结果与基于NHS琼脂糖磁珠的双抗夹心法结果相符合。进一步以4C8B11A10为金标抗体、1B4D6为捕获抗体为基础材料开展胶体金试纸条的制备工艺优化和初步应用评价。本研究通过分子克隆构建了DENV-3 NS1重组载体,并通过IPTG诱导、亲和层析获得DENV-3 NS1重组蛋白,并将其进行免疫制备抗体。而后经过三轮筛选及亚克隆共得到9株m Abs,并以NHS琼脂糖磁珠为固相进行抗体筛选及配对,最终获得3对配对抗体。以4C8B11A10为金标抗体、1B4D6为捕获抗体的胶体金试纸条检测下限为10 ng,临床样本测试均未出现假阳性和假阴性。抗DENV-3 NS1单克隆抗体的成功研制及配对抗体的筛选及评价为DENV基础研究提供有力的研究工具,同时,也为具有自主知识产权的DENV快检产品开发PUN30119细胞培养和推广奠定基础。