目的和意义:微生物发酵中药是一种中药制药新技术,它利用一种或几种微生物在人工控制条件下与中药共同作用获得特定代谢产物,具有降低中药毒性、增强中药药效并产生新的活性物质的优点。白花蛇舌草是一味清热解毒、提升机体免疫力的良药,白花蛇舌草中含有多种化学成分,黄酮类化合物是白花蛇舌草免疫调节主要活性成分之一,目前尚缺少微生物发酵白花蛇舌草总黄酮及发酵提取物对免疫调节影响作用的研究报道。本实验采用枯草芽孢杆菌和酿酒酵母菌两种益生菌单菌发酵白花蛇舌草提取总黄酮,分析不同发酵菌种和发酵条件对白花蛇舌草总黄酮含量的影响,并研究发酵对免疫抑制小鼠的免疫相关指标的影响,旨在为中药的开发利用寻求新途径,为白花蛇舌草活性成分在临床的开发利用提供实验基础。研究方法:分别在枯草芽孢杆菌和酿酒酵母菌培养基中加入不同浓度梯度的白花蛇舌草药液,不断驯化枯草芽孢杆菌和酿酒酵母菌,确定枯草芽孢杆菌和酿酒酵母菌最适宜发酵的白花蛇舌草药液浓度。以发酵液中总黄酮得率作为考查指标,用驯化后的枯草芽孢杆菌和酿酒酵母菌单菌发酵白花蛇舌草总黄酮,通过控制不同的接菌量、发酵温度、发酵培养基初始p H、摇床转速、发酵时间五个单因素变量优化发酵条件。选用7-8周龄,体重在18-20g左右的小鼠160只,按照雌雄各半随机总共分为16组。每个发酵菌种的实验小组是8组,除空白对照组外,其余7组每天用免疫抑制剂环磷酰胺80 mg/kg注射小鼠,连续注射三天,建立免疫抑制小鼠模型。发酵前后的白花蛇舌草总黄酮经提取纯化后,分别用高、中、低的剂量300、200、100mg/(kg·d),不同剂量的总黄酮按照0.1m L/10g的量灌喂小鼠,连续灌喂免疫抑制小鼠7天,实验设置空白对照组和实验对照组,分别连续用0.1m L/10g的生理盐水灌喂7天,所有组别在寻找更多末次给药24 h后安乐死处死小鼠,取眼球血,分离血清,采用称重法检测小鼠的脾脏指数,用酶联免疫吸附法测定血清免疫球蛋白(Ig G、Ig M、Ig A)和血清细胞因子(IL-2、IL-4、TNF-α、IFN-γ)的含量。实验结果:经过多轮驯化,在12%的白花蛇舌草药液环境下,枯草芽孢杆菌能够稳定生长繁殖。在16%的白花蛇舌草药液环境下,酿酒酵母菌能够稳定生长繁殖。通过单因素控制法,枯草枯草芽孢杆菌产总黄酮最多的单因素为接菌量3%、培养基初始发酵、发酵时间24h、发酵温度28℃、摇床转速200r/min。酿酒酵母菌产总黄酮最多的单因素为接菌量4%、培养基初始发酵p H7.5、发酵时间32h、发酵温度30℃、摇床转速200r/min。经微生物发酵后的白花蛇舌草总黄酮含量Groundwater remediation高于未发酵的总黄酮含量,枯草芽孢杆菌发酵后总黄酮得率较未发酵前提高11.14%,(P<0.05);酿酒酵母菌发酵后总黄酮得率较未发酵前提高9.27%,(P<0.05)。两个菌种的组通过动物实验,从动物器官指数来看,与空白对照组相比,实验对照组的器官指数(包括胸腺指数和脾脏指数)极显著降低(P<0.01),从血清中的免疫球蛋白(Ig G、Ig A、Ig M)和血清细胞因子含量(IL-2、IL-4、IFN-r、IFN-a)极显著降低(P<0.01),差异具有统计学意义。相同剂量下,发酵白花蛇舌草总黄酮对免疫抑制小鼠的免疫水平提升显著高于未发酵白花蛇舌草总黄酮。各实验组与实验对照组相比,两个发酵菌种发酵前后的白花蛇舌草总黄酮的低剂量组对免疫抑制小鼠的器官指数、免疫球蛋白含量和血清含量有显著提高的作用(P<0.05),发酵前后的白花蛇舌草总黄酮的中高剂量组对免疫抑制小鼠的器官selleck激酶抑制剂指数、免疫球蛋白含量和血清含量有极显著提高的作用(P<0.01),结论:用驯化后的枯草芽孢杆菌和酿酒酵母菌发酵白花蛇舌草总黄酮,确定发酵的最优工艺,相同剂量下,发酵的白花蛇舌草总黄酮对于提升免疫抑制小鼠的免疫指标效果高于未发酵组总黄酮。表明采用微生物发酵中药可以极大程度的提高中药有效成分,该发酵方法可行可靠。