碎米荠(Cardamine hirsute)是具有超聚硒特性的新食品原料,有极高的开发潜力和应用价值。目前,为了更好地利用碎米荠的硒资源,国内外学者对碎米荠植株本身及其提取物进行了深度研究,但对碎米荠硒肽的报道却鲜见。硒、肽均呈现优良的抗氧化活性,并且生物活性肽具有高安全性、低毒副作用的特点,以碎米荠为基础开发抗氧化活性硒肽,对碎米荠的应用和硒营养的发展具有重要意义。本文以恩施碎米荠为原料,利用膜分离、液质联用和分子对接技术对碎米荠硒肽(SeCPPs)分离、结构鉴定和虚拟筛选,再利用行为学、组织学等方法和高通量测序技术考察了碎米荠硒肽的体内抗氧化活性及其对肠道菌群的影响。主要研究结果如下:1碎米荠蛋白的提取及抗氧化SeCPPs的制备以蛋白提取率为指标,选取液料比、提取时间、碱液浓度等为关键因素,分别利用碱溶酸沉法和超声辅助碱溶酸沉法提取碎米荠蛋白(SeCP)。碱溶酸沉法的最佳提取条件为:Na OH溶液浓度为0.10 mol/L、液料比45:1(v/w)、提取温度60℃、提取时间3 h、提取2次,该条件下蛋白的提取率为72.91%;超声辅助碱溶酸沉法的最佳提取条件为:振幅35%、超声时间60 min、液料比40:1(v/w)、Na OH溶液浓度0.125 mol/L。此时,碎米荠蛋白的提取率为65.53%。综合对比,选择碱溶酸沉法为SeCP提取的最适方法。此外,SeCP含有丰富的必需氨基酸和疏水性氨基酸,分别约占总氨基酸的40.73%和42.64%。根据水解度、DPPH·和ABTS~+·清除率,筛选出水解SeCP的实验用酶为碱性蛋白酶,采用单因素实验优化了SeCPPs的最适制备条件为:底物浓度4.0%、酶解时间1 h、加酶量1.0%。再经超滤膜分离出截留分子量为1k Da的级分,此时SeCPPs的Microscopy immunoelectron硒含量为362.378 mg/kg,DPPH·和ABTS~+·清除率的EC_(50)值分别为0.435和0.399mg/m L,并且其还原力和Fe~(2+)螯合力呈现出剂量-效应依赖关系。2 SeCPPs的结构鉴定及抗氧化含硒肽段的筛选对SeCPPs进行UPLC-MS/MS分析,并与蛋白质数据库中碎米荠蛋白信息进行比对,共解析出84条含硒肽段,其中以三肽和四肽居多;其中51.76%的肽段含有硒代蛋氨酸(SeMet)、48.24%的肽段含有硒代半胱氨酸(SeCys)。采用分子对接技术进行虚拟筛选,对84条含硒肽段与DPPH·的亲和力进行预测,根据结合能≤-5.00kcal/mol从中选取了RSeMKL、RSeMR、RVSeMI、RASeMT、RSeCK、RSeML和SQSeML七条肽段,再经人工合成并进行活性验证。分子对接可视化和DPPH·清除实验结果显示,RVSeMI的DPPH·清除率最高,EC_(50)值为5.65 mmol/L,可通过氢键与DPPH·作用,并且其Val2和SeMet3与DPPH·还存在疏水相互作用。3 SeCPPs在体内的分布及其抗氧化活性评估在D-gal诱导的衰老小鼠模型中,行为学实验、血清、脑和肝脏生理指标、病理组织切片结果表明:(1)硒在小鼠骨头、毛发和血浆中的含量较低(<1.000 mg/kg),在脾脏、肝脏、肾脏和睾丸中的含量较高,SeCPPs(30μg Se/kg/d.bw)可显著提高正常小鼠血浆和毛发的硒浓度(p<0.05),能维持机体正常的抗氧化能力,并未对肝功能产生消极影响,SeMet(30μg Se/kg/d.bw)和Na_2SeO_3(30μg Se/kg/d.bw)可显著提高D-gal致衰老小鼠肝脏和肾脏的硒浓度(p<0.05)。(2)给予SeCPPs(15μg Se/kg/d.bw)和SeMet(30μg Se/kg/d.bw)均能够显著降低D-gal致衰老小鼠的脑乙酰胆碱酯酶(Ach E)活性、丙二醛(MDA)含量(p<0.05)以及衰老神经元VP-16作用细胞密度,www.selleck.cn/products/gsk-j4-hcl改善其空间学习记忆能力,并且能够提高其血清总抗氧化能力(T-AOC)以及肝脏谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性和T-AOC(p<0.05),改善肝脏炎细胞浸润和坏死症状;SeCPPs(15μg Se/kg/d.bw)还可以通过降低肝脏MDA含量、谷草转氨酶(AST)和谷丙转氨酶(ALT)活力,抑制肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)和白细胞介素(IL-6)的表达(p<0.05),减轻脂质过氧化和炎症反应,保护机体免受氧化损伤;而Na_2SeO_3(30μg Se/kg/d.bw)则对D-gal致衰老小鼠抗氧化能力的提升和组织损伤无显著影响(p>0.05)。4 SeCPPs对小鼠肠道菌群的影响在正常小鼠中,给予SeMet(30μg Se/kg/d.bw)会导致肠道菌群的Shannon和Simpson指数极显著下降(p<0.01)以及β多样性变化,其肠道菌群组成与正常小鼠相比,差异变大,拟杆菌门(Bacterodetes)与厚壁菌门(Firmicutes)比例急剧下降,变形菌门(Proteobacteria)丰度极显著提高(p<0.01),肠道菌群失调;给予Na_2SeO_3(30μg Se/kg/d.bw)和SeCPPs(30μg Se/kg/d.bw)后,其α和β多样性无显著变化,在门和属水平上调节部分微生物群的丰度,不利于肠道稳态;而给予SeCPPs(60μg Se/kg/d.bw)亦对α和β多样性无显著影响,其肠道菌群基因所反映的功能通路与正常小鼠无显著差异,但极显著降低了幽门螺杆菌(Helicobacter)、提高了普雷沃菌属(Prevotellaceae＿UCG＿001)和Muribaculum的丰度(p<0.01),优化了肠道菌群结构。在抗生素暴露小鼠模型中,给予Na_2SeO_3(30μg Se/kg/d.bw)能显著降低了Ace指数和Chao1指数(p<0.05),极显著提高了阿克曼菌(Akkermansia)丰度,其肠杆菌(Enterobacter)占肠道菌群总丰度的75.10%,不利于失衡肠道菌群的恢复;给予SeMet(30μg Se/kg/d.bw)对肠道菌群的α和β多样性无显著影响,在属水平上能够降低麦芽窄食单胞菌(Stenotrophomonas)丰度,对肠道菌群的恢复影响较小;而给予SeCPPs(30μg Se/kg/d.bw)在门水平上极显著提高了Firmutes的丰度、降低了Proteobacteria的丰度,在属水平上极显著降低了Stenotrophomonas丰度,有利于肠道菌群的恢复;给予SeCPPs(60μg Se/kg/d.bw)在门水平上极显著提高了Bacterodetes的丰度、降低了Proteobacteria的丰度,在属水平上提高了Akkermansia和Erysipelotrichaceae的丰度、降低了Stenotrophomonas和假单胞菌属(Pseudomonas)的丰度(p<0.01),并且其肠道菌群所反映的癌症、神经退行性疾病、心血管疾病等人类疾病和衰老功能基因丰度极显著下降(p<0.01),能使与碳水化合物、其他次级代谢产物生物合成转化、糖类生物合成和代谢等代谢功能相关通路的基因丰度极显著提高(p<0.01),有利于肠道菌群的恢复。