阿尔茨海默症(Alzheimer’s disease,AD)是由神经细胞死亡或退化引起的疾病,会导致记忆力、认知能力、运动功能等方面的逐渐恶化,给患者和家庭带来了巨大的负担和压力。而神经轻链蛋白(Neurofilament light chain,Nf L)是一种在神经元轴突中高度表达的蛋白质,其主要功能是维护和支持轴突的结构和稳定性。一些研究表明,当轴突受损或死亡时,Nf L蛋白会释放到周围环境,因此血液和脑脊液中白Nf L水平可以用于反映大脑中神经元损伤和死亡的程度,用于预测和鉴定AD。近年来,Nf L蛋白的测定技术迅速发展并不断完善,开发了包括Simoa技术在内的可以检测到更低水平Nf L蛋白的一系列高灵敏度免疫检测技术。尽管测定技术不断进步,但Nf L蛋白高准确度绝对定量方法仍然是个难题。由于Nf L蛋白没有准确定量标准,导致不同国家、实验室间对Nf L测量的selleck激酶抑制剂结果没购买Trichostatin A有可比性。因此本研究建立了一套基于同位素稀释质谱法(IDMS)的Nf L高准确度绝对定量方法。(1)建立基于氨基酸同位素稀释质谱法(AA-based IDMS)的Nf L绝对定量方法。本方法采用液相色谱串联质谱(LC-MS)测量Nf L蛋白酸水解产生的脯氨酸(Pro)、苯丙氨酸(Phe)、亮氨酸(Leu)和缬氨酸(Val)以及对应的同位素标记氨基酸内标,得到Nf L的准确量值。测量过程中对酸水解的实验条件如水解时长、盐酸添加量以及LC-MS仪器参数进行优化,得到Nf Biogenic Mn oxidesL定量结果为218.00±4.73μg/g。(2)建立基于肽段的同位素稀释质谱法(Signature peptide-based ID-LCMS)的Nf L绝对定量方法。本方法筛选并验证三条肽段FR-7(FASFIER)、AR-8(ALYEQEIR)和FK-10(FTVLTESAAK)为Nf L的特征肽段,然后使用氨基酸同位素稀释质谱法对该三条肽段进行定量得到准确量值。接着对Nf L进行酶解并与三条肽段对应的同位素标记肽段使用液相质谱(LC-MS)的多反应监测模式(MRM)进行测量,优化酶解实验条件、肽段离子对和LC-MS的仪器参数。最终经三条肽段对Nf L的定量结果平均为217.49±5.56μg/g。(3)建立基于硫元素同位素稀释质谱法(Sulfur-based ID-ICP-MS)的Nf L绝对定量方法。本方法采用高效液相色谱(HPLC)和高分辨等离子体质谱(HR-ICP-MS)串联,使用尺寸排阻色谱柱(SEC)对Nf L样品进行分离,之后经柱后添加~(34)S同位素稀释剂并同时监测~(32)S和~(34)S信号比,通过计算S元素的含量,计算得到Nf L的定量结果为215.58±1.00μg/g。通过三种独立方法对简单基质中Nf L的含量进行准确测定,三种定值方法的总平均值为217.06±4.08μg/g。三种方法的结果较为一致,进一步验证了基于IDMS方法进行蛋白质绝对定量的准确性和可靠性。该研究为后续Nf L的标准物质研制奠定了基础,对NDD生物标志物的准确定量方法开发提供了重要的参考和指导。