亚油酸异构酶被认为是亚油酸转化为共轭亚油酸的关键酶,可直接催化亚油酸直接合成共轭亚油酸。科学界目前从多种菌株中检测并提取出了亚油酸异构酶,其酶学性质并不一致,甚至在同属不同种菌株之间酶学性质亦有差异。共轭亚油酸具有具有抗癌、提高机体免疫、减肥降脂、预防动脉硬化等重要生理功能,但自然合成产量较低,因此对提升共轭亚油酸产量进行了研究。本研究以课题组之前构建的重组菌作为原材料,利用荧光定量PCR技术,以野生型菌株为标准,rec A作为内参基因,13株正突变菌株作为待测菌株,进行荧光定量PCR检测,结果发现,与野生型菌株相比,13株菌CB-839株的基因表达量都有不同程度的提升,其中P84,P137,P173,P188号菌株相对表达量较高,P173号菌株的基因相对表达量最高,达到了22.571。与酶活检测的结果对比,发现P84,P137,P173,P188号菌株的CLA含量也INCB018424较高,且P173号菌株最高,达到了16.13±0.59μg/m L。说明基因表达量与酶活呈正相关。根据转录组和代谢组联合分析结果,利用CRISPR/Cas9技术对预测的关键基因gat A进行了敲除,得到了敲除菌株Δgat A-CLA,并构建回补菌株来验证基因功能,结果证明,gat A可以影响半乳糖代谢,促进戊糖磷酸循环产生更多的NADPH和ATP,NADPH和ATP的增多使得脂质合成速率增加,有利于脂质的合成,亚油酸异构酶的酶活升高。敲除菌株CLA含量达9.15±0.20μg/m L,是回补菌株的2.71倍,原始菌株的3.09倍,说明gat A是影响亚油酸异构酶酶活的基因。优化P173菌株的培养基和产酶条件,最优条件为以2%的葡萄糖作为碳源,2%的牛肉粉作为氮源,初始p H=7.39,IPTG诱导时间为20.52 h,亚油酸添加量终浓度0.76 mg/m L时,可达到最优产量,CLA含量为20.24±1.07mg/m L,与初始菌株相比,产CLA能力提升约20%。并通过亲和层析法对粗酶液进行纯化,利用纯化后的酶液进行富含CLA奶酪的制备,最终得到最佳工艺条件为酶液添加量为0.3 m L,发酵温度为37℃时,奶酪中共轭亚油酸的含量均达到最优值,共轭亚油酸含量可达6.35±0.73 mg/g,约为原始奶酪的1.79倍,此时奶酪的硬度,弹性,咀嚼型,粘聚性等质构特性均与传统新鲜奶酪相似,证明本款奶酪的开发Prosthetic joint infection符合国人的口感需求并提升了奶酪的营养价值。本文对酶活提升的菌株荧光定量PCR的检测,并利用CRISPR/Cas9技术对预测的关键基因gat A进行了敲除,确定了gat A对亚油酸异构酶的影响,并最终利用得到的高酶活菌株开发了一款富含CLA的奶酪,丰富了人们对乳制品的选择,并为进一步阐释影响亚油酸异构酶酶活的作用机理提供理论依据。