背景:食管鳞状细胞癌(Esophageal squamous cell cancer,ESCC)是我国常见恶性肿瘤之一。世界卫生组织(WHO)数据显示,2020年我国食管癌新发病例42.4万例,死亡病例30.1万例,分别占全球食管癌发病数的53.7%,死亡数的55.4%。ESCC具有早期发病隐匿,恶性程度高,易复发和转移等特点,缺乏准确的肿瘤检测标志物,导致大多数ESCC患者确诊时多处于中晚期,错过手术治疗黄金时期,故多采用放化疗以及靶向治疗。顺铂作为临床常用化疗药物,用于多种恶性肿瘤的治疗,但长期使用易产生化疗耐药,并且其耐药机制目前尚未具体阐明,为此寻找增加肿瘤细胞化疗敏感性的新方法就显得尤为重要。进一步阐明ESCC发生发展的潜在分子作用机制,对降低ESCC发病率和死亡率具有重要意义。肿瘤是机体在各种致癌因素作用下,局部组织的某一个细胞在基因水平上失去对其增殖的正常调控,导致其克隆性异常增生而形成的新生物。目前,恶性肿瘤已经成为威胁我国国民生命健康的主要因素之一,因其具有分化增殖异常、高浸润性以及高转移性等特点,给患者造成巨大的经济负担并影响其生存质量。研究发现,与机体正常细胞相比,大多数肿瘤细胞的端粒长度不会随着增殖次数的增加而缩短,这可能与其无限增殖的生物学属性存在潜在联系。因此,研究肿瘤发病机制对肿瘤治疗策略的制定具有重要意义。端粒作为存在于真核细胞线性染色体末端的特殊结构,由串联重复的DNA序列(TTAGGG)和蛋白质组成,参与维持染色体结构完整性和基因组稳定性。端粒保护蛋白复合体作为端粒重要组成部分之一,即Shelterin结构,由六个蛋白质亚基组成:TPP1、POT1、TRF1、TIN2、TRF2和Rap1。TPP1作为Shelterin结构发挥端粒保护功能的关键分子之一,通过与POT1相互结合形成TPP1-POT1异源二聚体招募端粒酶加入到端粒末端,复制延长端粒。同时TPP1-POT1异源二聚体可介导POT1对端粒单链DNA 3’末端的保护,避免其被错误识别为断裂DNA,激活ATM依赖的DNA损伤反应,影响染色体结构稳定性和基因组稳定性。此外,TPP1异常表达与多种肿瘤密切相关,如慢性淋巴细胞白血病、胶质瘤和黑色素瘤等。课题组前期研究发现,在小鼠成纤维细胞中抑制TPP1表达可诱发ATM依赖的DNA损伤反应,继而激活p53介导的细胞衰老,但在缺乏ATM依赖的DNA损伤反应情况下,TPP1缺失则导致端粒功能障碍,促进正常细胞的恶性转化,最终导致肿瘤的形成。由此,我们作出科学推测:TPP1表达异常可能与ESCC发生发展存在潜在联系,但其具体分子机制尚不明确。本研究拟通过在ESCC细胞中干预TPP1表达,探索TPP1表达异常是否参与ESCC发生发展及其可能的分子机制,为ESCC的诊断治疗提供潜在chronic viral hepatitis的肿瘤标志物和治疗靶点。此外,我们发现在胃鳞癌细胞中抑制TPP1表达可以抑制其增殖活力,增加其对顺铂的化疗敏感性,进而促进胃鳞癌细胞凋亡。本实验使用顺铂处理敲低和过表达TPP1的ESCC细胞,探究TPP1表达水平与ESCC细胞顺铂化疗敏感性的关系。目的:1.阐明TPP1在ESCC发生发展中的生物学作用。2.阐明TPP1调控ESCC细胞DNA损伤反应的分子机制。3.探索TPP1与ESCC细胞顺铂化疗敏感性的关系。方法:1.借助生物信息学数据库分析TPP1 m RNA和蛋白在ESCC组织和癌旁组织中的表达水平。2.构建包含TPP1敲低质粒的慢病毒并感染ESCC细胞KYSE150和TE1;q RT-PCR检测转染TPP1敲低质粒后ESCC细胞中TPP1 m RNA表达水平;Western blot检测转染TPP1BMS-907351生产商敲低质粒后ESCC细胞TPP1蛋白及下游相关蛋白的表达水平;CCK-8实验检测敲低TPP1后ESCC细胞增殖活力变化;细胞划痕实验检测敲低TPP1后ESCC细胞迁移能力变化;流式细胞术检测敲低TPP1后ESCC细胞生长周期变化;β-半乳糖苷酶染色评估敲低TPP1后ESCC细胞衰老变化;细胞免疫荧光实验检测敲低TPP1后ESCC细胞核中蛋白γ-H_2AX表达水平;彗星实验评估敲低TPP1后ESCC细胞DNA损伤严重程度。3.裸鼠荷瘤模型体内评估敲低TPP1对ESCC细胞体内成瘤的影响;q RT-PCR检测ESCC移植瘤组织中TPP1 m RNA表达水平;Western blot检测ESCC移植瘤组织中TPP1、p ATM、p ATR和γ-H_2AX等蛋白表达水平;免疫组织化学染色(Immunohistochemistry,IHC)检测ESCC移植瘤组织中TPP1、γ-H_2AX和Ki67蛋白表达水平。4.构建TPP1过表达慢病毒感染敲低TPP1的ESCC细胞KYSE150和TE1;q RT-PCR检测转染TPP1过表达质粒后ESCC细胞中TPP1 m RNA表达水平;Western blot检测转染TPP1过表达质粒后ESCC细胞中TPP1蛋白及下游相关蛋白的表达水平;CCK-8实验检测过表达TPP1后ESCC细胞增殖活力变化;划痕实验检测过表达TPP1后ESCC细胞迁移能力变化;β-半乳糖苷酶染色评估过表达TPP1后ESCC细胞衰老变化;彗星实验评估过表达TPP1后ESCC细胞DNA损伤严重程度。5.裸鼠荷瘤模型体内评估过表达TPP1对ESCC细胞体内成瘤的影响;q RT-PCR检测ESCC移植瘤组织中TPP1 m RNA表达水平;Western blot检测ESCC移植瘤组织中TPP1、p ATM、p ATR和γ-H_2AX等蛋白表达水平;IHC检测ESCC移植瘤组织中TPP1、γ-H_2AX和Ki67等蛋白表达水平。6.顺铂处理敲低和过表达TPP1的KYSE150和TE1细胞,CCK-8实验检测顺铂处理后ESCC细胞增殖活力变化;划痕实验检测顺铂处理后ESCC细胞迁移能力变化。PUN301197.裸鼠荷瘤模型体内评估顺铂对过表达TPP1的ESCC细胞体内成瘤的影响;IHC实验检测ESCC移植瘤组织中Ki-67蛋白表达水平;苏木素伊红染色(Hematoxylin eosin,HE)评价顺铂对裸鼠心、肝、脾、肺、肾的器官毒性。结果:1.生物信息学数据库分析发现,TPP1在多种消化道恶性肿瘤中高表达,主要包括结肠腺癌、食管鳞癌、直肠腺癌等;TPP1 m RNA在ESCC中的表达水平显著高于癌旁组织(p<0.001)。此外,ESCC组织中TPP1蛋白表达水平显著高于癌旁组织。2.体外实验证实,敲低TPP1后KYSE150和TE1细胞的增殖活力和迁移能力均显著降低(p<0.01),细胞衰老率显著上升(p<0.05);在稳定敲低TPP1的KYSE150和TE1细胞中过表达TPP1,可部分逆转因敲低TPP1导致的细胞增殖活力和迁移能力下降(p<0.01),同时缓解细胞衰老(p<0.05)。3.敲低TPP1后,KYSE150和TE1细胞的彗星发生率、彗星尾长、彗星尾部DNA比例以及彗星尾距均显著增加(p<0.05);在稳定敲低TPP1的KYSE150和TE1细胞中过表达TPP1后,ESCC细胞的彗星发生率、彗星尾长、彗星尾部DNA比例以及彗星尾距均显著下降(p<0.05)。4.敲低TPP1后,KYSE150和TE1细胞的G1期标志蛋白(CDK4、CDK6、Cyclin D1)表达受到抑制,生长周期阻滞于G1期,伴随衰老相关蛋白(p53和p21)和DNA损伤相关蛋白(p ATM、p ATR、p Chk2、p Chk1和γ-H_2AX)的表达上调;在稳定敲低TPP1的KYSE150和TE1细胞中过表达TPP1后,衰老相关蛋白(p53和p21)和DNA损伤相关蛋白(p ATM、p ATR、p Chk2、p Chk1和γ-H_2AX)的表达下调。5.裸鼠荷瘤模型证实敲低TPP1显著降低ESCC移植瘤的体积和重量(p<0.01),下调移植瘤组织中增殖标志物Ki-67蛋白的表达,伴随蛋白p ATM、p ATR和γ-H_2AX的表达上调;过表达TPP1显著增加ESCC移植瘤的体积和重量(p<0.05),上调移植瘤组织中Ki-67蛋白的表达,并伴随蛋白p ATM、p ATR和γ-H_2AX的表达下调。6.顺铂(0.1μM,24 h)进一步抑制敲低TPP1的ESCC细胞的增殖活力(p<0.001);过表达TPP1可抵抗顺铂对ESCC细胞增殖活力及迁移能力的抑制(p<0.001)。7.裸鼠荷瘤模型证实过表达TPP1能够逆转顺铂对ESCC移植瘤增殖能力的抑制(p<0.05),降低ESCC对顺铂的敏感性。HE染色结果提示裸鼠器官的组织形态学无显著变化,证实顺铂对裸鼠心、肝、脾、肺、肾无明显器官毒性。结论:1.TPP1在ESCC中高表达,通过ATM/ATR-p53信号通路调控DNA损伤反应和细胞衰老并参与ESCC的发生发展。2.过表达TPP1降低ESCC细胞对顺铂的化疗敏感性,可能与临床化疗抑制存在潜在联系。