DNA修饰酶广泛参与DNA复制、修复和重组等各种遗传功能,DNA修饰酶的错误表达可能会扰乱正常的遗传功能,从而引起各种人类疾病(如神经退行性疾病、肺癌、淋巴癌)。因此,准确灵敏的检测DNA修饰酶对环境监测、抗癌药物开发和临床诊断具有重要意义。等温核酸扩增作为生物化学的一门基本技术,在提高检测DNA修饰酶的灵敏度方面被不断开发应用,在本文中,我们利用等温核酸扩增开发了两种生物传感器,实现了对尿嘧啶DNA糖基化酶、人烷基腺DNA糖基化酶(Uracil DNA glycosylase,UDG;Human alkyladenine DNA glycosylase,h AAG)和β-葡糖基转移酶(β-glucosyltransferase,β-GT)的灵敏检测。我们开发了一种基于靶标触发DNAzyme马达构建电化学生物传感器同时检测多种DNA糖基化酶(UDG/h AAG)。DNA糖基化酶(UDG/h AAG)与DNA损伤修复有关,是重要的疾病生物标志物。本工作中方法包括两个感应尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)和人烷基腺嘌呤DNA糖基化酶(h AAG)的发卡,一个包含Mg~(2+)/Pb~(2+)locked DNAzyme链和Mg~(2+)/Pb~(2+)DNAzyme链杂交的Au NPs@locked DNAzyme马达,以及一个包含MB/Fc标记Mg~(2+)/Pb~(2+)底物链的磁珠轨道。当UDG和h AAG存在时,它们可以切割相应的发夹DNA探针,释放两条单链DNA(ss DNAs),单链DNA(ss DNA)与Mg~(2+)/Pb~(2+)locked DNAzyme链杂交,诱导Mg~(2+)/Pb~(2+)DNAzyme链从Au NPs@locked DNAzyme马达中释放。随后,Mg~(2+)/Pb~(2+)DNAzyme链与其相应Mg~(2+)/Pb~(2+)底物链杂交,导致Mg~(2+)/Pb~(2+)底物链断裂,MB/Fc标记的单链DNA(ss DNAs)从磁PD-0332991珠中释放。释放出MB/Fc标记的单链DNA可以被进行电化学检测,用于UDG/h AAG的准确定量,UDG的检测限为1.3×10~(-8)U m L~(-1),h AAG的检测限为7.6×10~(-8)U m L~(-1)。该DNAzyme马达具有高灵敏度和良好的特异性,能够同时检测He La细胞中的多种DNA糖基化酶并筛选潜在的BVS bioresorbable vascular scaffold(s)抑制剂。我们开发了一种基于T7滚环扩增产生串联“菠菜”(Spinach)RNA适配体的荧光生物传感器检测β-葡糖基转移酶(β-GT)。β-葡萄糖基转移酶(β-GT)可以特异性催化5-羟甲基胞嘧啶(5-hm C)转化为5-葡糖基羟甲基胞嘧啶(5-ghm C),保护感染病毒DNA不被限制性内切酶消化,并通过影响体内和体外转录与控制噬菌体特异性基因表达密切联系。然而,目前的策略存在设备昂贵、处理GW4869核磁费力、放射性危险和灵敏度不理想等问题。在此,我们开发了一种基于“菠菜”的新型无标记荧光生物传感器,通过产生串联“菠菜”RNA适配体的5-hm C糖基化启动滚环转录(RCT)扩增,用于灵敏检测β-GT活性。5-hm C修饰的多功能检测探针(MDP)可以诱导目标识别、Msp I消化、转录扩增等功能。β-GT催化的5-hm C糖基化可以保护5-hm C MDP探针免受Msp I切割,随后启动RCT生成串联“菠菜”RNA适体,通过添加荧光染料3,5-二氟-4-羟基苄基咪唑啉酮(DFHBI)以无标记方式定量分析β-GT。低背景信号可以通过抑制非特异性扩增来实现,因为Msp I消化非糖基化DNA底物具有很高的准确性和特异性。由于RCT比典型启动子启动的RNA合成效率更高,与基于线性模板的转录扩增(LTTA)相比,RCT的信噪比提高了约4.6倍。该方法特异性好,灵敏度高,检出限低至2.03×10~(-5) U m L~(-1),可进一步用于潜在抑制剂筛选和动力学分析,在表观遗传学研究和药物发现方面具有广阔的应用前景。