研究背景与目的:胶质母细胞瘤约占所有恶性脑肿瘤的46%,预后差,只有5%的患者存活时间能达到5年以上。免疫检查点抑制剂的免疫治疗,如PD-1(程序性细胞死亡蛋白1)/PD-L1(程序性细胞死亡配体1)通路的阻断,在不同类型的肿瘤患者中产生了有希望的结果,但是这些治疗方式没有使胶质母细胞瘤患者获得显著的生存获益。血脑屏障是由脑血管内皮细胞及其紧密连接、毛细血管基底膜,以及周细胞和星形胶质细胞的足突组成,是具有保护功能的膜屏障,能够将中枢神经系统与血液成分分开,阻止大部分物质由血液系统进入脑实质内。尽管胶质母细胞瘤中免疫细胞浸润的存在表明血脑屏障的完整性可能会受到中枢神经系统肿瘤发展的影响,但研究发现,血脑屏障仍然是药物进入中枢神经系统肿瘤的主要生理障碍。因此,通过血脑屏障递送免疫检查点抑制剂的策略对于成功的胶质母细胞瘤免疫治疗至关重要。小干扰RNA(siRNA)技术是一种有效的靶向基因沉默手段,已越来越多地用于肿瘤的免疫治疗中。游离的siRNAs由于其较差的药代动力学、较低的肿瘤靶向性和细胞摄取不足而不适合用于治疗,因此siRNAs通常与肿瘤免疫治疗的载体复合,形成治疗复合物。阳离子脂质体纳米颗粒作为siRNA载体具有良好的生物相容性、生物降解性和结构柔性。可电离的阳离子脂质体通常有一个胺头基团,它对siRNA的有效包封和细胞内传递至关重要。尽管血脑屏障被认为是无靶向配体的纳米药物载体治疗颅内肿瘤的一个巨大限制,但是已经开发了几种被动靶向纳米载体,用于在原位脑胶质瘤模型中透过血脑屏障。最近的研究表明,表面正电荷提高了聚合物纳米药物递送系统的血脑屏障通透性。然而,利用阳离子脂质体纳米药物递送系统直接将siRNA递送到大脑并有效穿透血脑屏障,从而提高胶质母细胞瘤免疫治疗效果的研究较少。金纳米颗粒是纳米尺度的金属材料,在众多纳米材料中,金纳米颗粒具有低毒性、易于控制粒径和形状、局域表面等离子体共振等优点,因此,在肿瘤传感器、药物释放剂和增强剂在等离子体光热疗法中的应用已有广泛研究。目前的研究热点之一就是延长体内循环时间和肿瘤富集,这是实现纳米颗粒有效递送的关键特征。在论文的前一部分,我们设计了一个具有不同胺头基团的可电离阳离子脂质体库,用于脑靶向siRNA递送。我们发现脂质体的胺头基团的结构是决定其对siRNA递送效率、血脑屏障穿透效果和脑肿瘤靶向能力的有效性的关键因素。利用体外和体内筛选方法,我们获得了一种性能突出的脂质体BAMPA-O16B,其p Ka值在6.5左右,是一种有效的载体,可在体外将siRNAs导入胶质母细胞瘤肿瘤细胞的细胞质内,并在小鼠原位胶质母细胞瘤模型中递送入颅内肿瘤组织。我们进一步证明了BAMPA-O16B递送siRNA同时沉默颅内胶质母细胞瘤中CD47和PD-L1表达的潜力,这两种免疫抑制分子参与肿瘤诱导的免疫抑制。我们发现同时沉默CD47和PD-L1表达在激活抗肿瘤免疫方面比单独靶向任何一个分子对于肿瘤的治疗更有效,突出了使用脑靶向脂质体autoimmune featuressiRNA递送用于胶质母细胞瘤和其他脑肿瘤的免疫治疗的巨大潜力。在论文的后一部分,我们应用聚乙二醇化的金纳米杈(NTP@PEG),与尺寸相当的金纳米球和金纳米棒相比,NTP@PEG对原位胶质母细胞瘤荷瘤小鼠具有明显的蛋白吸附抵抗性,减少了其在网状内皮系统的吞噬,在肝脏和脾脏中的蓄积量低,对血脑屏障的穿透能力高。另一方面,NTP@PEG纳米颗粒显示出较长的血液循环半衰期,使胶质母细胞瘤内积聚量增加,并能够深度渗透到肿瘤内。基于NTPs具有近红外表面等离子体共振效应,因此应用NTP@PEG经系统给药,对荷瘤小鼠原位胶质瘤进行光热疗法,发现其对肿瘤的生长有明显的抑制作用。因此,NTPs为药物的递送提供了一个理想的平台,为脑疾病的治疗提供了广阔的前景。研究方法:1.构建包含不同胺头基团的脂质体材料库,合成多种脂质体纳米药物递送系统,验证其包载siRNA后对靶基因的沉默效率。对比具有不同靶基因沉默效率的脂质体纳米药物递送系统,明确其差异产生的机制。2.选出对靶基因沉默效率和血脑屏障透过效率最高的脂质体纳米药物递送系统BAMPA-O16B/siRNA,利用实验方法检测其在体外和体内被肿瘤细胞摄取,以及其对CD47和PDL1分子表达的沉默效率。3.检测经系统给药后,BAMPA-O16B/siCD47/siPDL1对GL261肿瘤生长的影响并观察小鼠生存期,利用流式细胞术检测BAMPA-O16B/siCD47/siPDL1的抗肿瘤免疫反应机制。4.比较不同形貌的金纳米颗粒对血清蛋白的吸附能力,检测其透过血脑屏障的能力以及在肿瘤组织内的分布。5.对颅内荷瘤小鼠经系统给药后,检测NTP@PEG介导的光热治疗对肿瘤生长的抑制效果。研究结果:1.包含不同胺头基团的脂质体纳米药物递送系统在包载了si GFP后,对GL261-GFP表达GFP的水平的沉默效率不同。选出沉默效率具有显著差异的4种胺头基团的脂质体纳米颗粒,对其细胞吞噬、溶酶体逃逸、p Ka值,以及透过体外血脑屏障模型的能力进行检测,发现阳离子脂质材料的p Ka值在6-7之间的纳米药物递送系统具有较强的溶酶体逃逸能力和血脑屏障穿透性。2.利用BAMPA-O16B阳离子脂质药物递送系统包载荧光标记的siRNA,体外与GL261细胞共孵育,可见肿瘤细胞对BAMPA-O16B/siRNA有较强的吞噬作用。利用BAMPA-O16B脂质包载CD47 siRNA和PD-L1 siRNA,体外与GL261细胞共孵育,发现BAMPA-O16B/siCD47/siPDL1能够在体外有效降低肿瘤细胞CD47和PD-L1的表达,且其沉默效率与商业化的转染试剂Lipofectamine2000相近。3.利用BAMPA-O16B脂质包载荧光标记的siRNA,Alisertib对颅内胶质母细胞瘤的荷瘤小鼠经系统给药,可见BAMPA-O16B/Cy5-si NC显著富集在肿瘤组织的胞浆内,而在正常的脑组织内富集很少。BAMPA-O16B/siCD47/siPDL1在体内可以使肿瘤组织内的CD47和PD-L1的表达水平下降,具有较高的瘤内递送效率。4.BAMPA-O16B/siCD47/siPDL1经系统给药后,能够显著抑制颅内荷瘤小鼠的肿瘤生长,并显著延长荷瘤小鼠的生存时间,同时降低Ki-67+细胞的比例,该免疫反应是由CD8+T细胞浸润增加和肿瘤相关巨噬细胞及其M2亚型的比例降低所致。5.将不同形貌的三种金纳米颗粒NTP@PEG、NS@PEG和NR@PEG与血清蛋白共孵育后,发现NTP@PEG具有www.selleck.cn/products/nvp-tnks656较强的抗蛋白吸附能力,同时具有较好的血脑屏障透过能力,能够在颅内胶质母细胞瘤肿瘤内有较强的富集能力,而在肝脏、脾脏等脏器内的富集较少。6.利用NTP@PEG对颅内荷瘤小鼠进行光热治疗,可以抑制肿瘤的生长,延长小鼠生存,其机制是由于光热效应引起肿瘤细胞的凋亡所致。研究结论:1.包含不同胺头基团的脂质体纳米药物递送系统对靶基因的沉默效率不同,并且透过体外或体内血脑屏障的效率也不同,其差异可能是由表面性质决定的。2.阳离子脂质材料的p Ka值约为6.5左右,具有高效靶基因沉默功能,低于5.5的阳离子脂质材料对靶基因的沉默能力很差。3.荧光标记的BAMPA-O16B/siRNA在体外和体内实验中均能够有效被肿瘤细胞摄取,同时高效沉默CD47和PD-L1分子的表达。4.BAMPA-O16B/siCD47/siPDL1能显著抑制小鼠胶质母细胞瘤肿瘤的生长,并能延长荷瘤小鼠的生存时间,其作用机制是通过增加肿瘤组织中CD3+T细胞、活化的CD8+T细胞的浸润,同时降低肿瘤相关巨噬细胞的总数和M2型亚群比例实现的。5.NTPs具有独特的枝杈状结构,与尺寸相似的金纳米球和金纳米棒相比,NTP@PEG有较强的血清蛋白吸附抵抗能力,同时能透过体外血脑屏障模型,并且在颅内肿瘤部位能够透过血脑屏障而进入脑组织,实现在肿瘤部位的富集。6.NTP@PEG由于其在808 nm具有较好的光热转换效率,故应用近红外激光照射颅内荷瘤小鼠后,能够使瘤内肿瘤细胞凋亡,进而减慢小鼠肿瘤生长,延长小鼠的生存时间。