β-葡聚糖酶是一类能够催化β-葡聚糖的酶的总称,属于糖苷水解酶类(Glycoside 此网站hydrolases,GH),主要包括β-1,4-葡聚糖酶(EC 3.2.1.4),β-1,3-1,4-葡聚糖酶(EC 3.2.1.73)以及β-1,3葡聚糖酶(EC 3.2.1.39),在啤酒酿造,制糖,饲料,造纸等领域有广泛应用。目前已知的β-葡聚糖酶大多数为中性酶,最适温度多在40-50℃之间,不能满足发酵、食品等行业在高温过程的需要,在造纸、饲料等高温和极端p H条件下应用时活性损失较大,而对于耐oral and maxillofacial pathology热耐碱的β-葡聚糖酶的发掘和应用依然欠缺。本论文基于半理性设计以及酶工程的方法理论,利用二硫键的引入以及片段替换等手段,成功提高了分别来源于类芽孢杆菌和嗜碱芽孢杆菌的β-1,3-1,4-葡聚糖酶和β-1,4-葡聚糖酶的耐热性,并在大肠杆菌BL21(DE3)以及毕赤酵母GS115中表达,最后将耐热性提高的两种葡聚糖酶在制浆领域进行应用研究。主要研究结果如下:(1)对来源于类芽孢杆菌的β-1,3-1,4-葡聚糖酶,构建了大肠杆菌表达体系,引入了冰核蛋白便于酶表达在细胞表面,基于蛋白质的结构分析筛选出了三组引入二硫键的突变位点:K18C-A34C,T36C-G69C和S102C-G231C。通过酶学性质比较结果显示引入二硫键T36C-G69C后的突变酶Eccsl69的最适温度由55℃提升到80℃,且最适p H在9-10,在75℃下保温1 h能保持50%以上的活性,且具有良好的金属离子耐受性,发酵液酶活力2450.72 U/m L,纯化后比酶活达到57664 U/mg。(2)对来源于嗜碱芽孢杆菌的β-1,4-葡聚糖酶,构建了大肠杆菌表达体系,引入冰核蛋白便于酶表达在细胞表面,通过半理性设计方案检索到来源于枯草芽孢杆菌,氨基酸序列相似度为66%的耐热葡聚糖酶,通过片段替换使原始酶Eccsl H的N端,分别替换7个和5个氨基酸,构建了突变酶Eccsl Ht1和Eccsl Ht2,纯化后Eccsl Ht1和Eccsl Ht2比酶活力分别为6415.12 U/mg和9013.6 U/mg。其中酶Eccsl Ht2的最适温度由60℃提高到65℃,且最适p H在8-9之间,在此基础上分别引入了四组二硫键L28C-S256C、Q41C-P278C、S122C-N163C和A184C-A215C,其中L28C-S256C、Q41C-P278C两组在维持最适温度不变的情况,70℃下保温40 min残余相对酶活由0%提高到56.3%和49.7%。(3)将半理性设计方法得到的β-1,3-1,4葡聚糖酶Eccsl69以及β-1,4-葡聚糖酶Eccsl Ht2的基因分别连接至质粒p PIC9K上,并转化到毕赤酵母GS115中实现表达,发酵结果显示,β-1,3-1,4-葡聚糖酶的活力达到47536.76 U/m L,用该酶处理秸秆草浆后,打浆度由55.0°SR降低至47°SR,增强了水的滤过性,成纸性能得到提高,纤维长度缩短2.23%,抗张力提高30.05%,抗环压力提高10.7%,抗撕裂力提高16.6%。在毕赤酵母GS115中表达的β-1,4-葡聚糖酶(Eccsl Ht2)的活力达到6234.92 U/m L,在p H为9,温度为70℃的高温碱性环境下,每克绝干浆加入酶量1952.16 U,反应8 h后。打浆度由31.0°SR降低至25°SR。纸张的抗张力Erastin配制下降1.4%,抗环压力下降1.5%以及抗撕裂力下降2.3%,在增强滤水性的同时,对纸张性能影响较小。