废水中含氮化合物超标会促进藻类等浮游生物的过度繁殖,引起水富营养化,导致水质恶化,严重危害生态环境和人体健康。生物脱氮法由于经济、高效、无二次污染等特点,是目前含氮废水处理中最常用的方法。但是,传统脱氮微生物菌群生长不同步,且世代周期长,污染物耐受浓度低,极大地限制了生物脱氮技术的应用和发展。而异养硝化-好氧反硝(HN-AD)菌不仅能有效去除废水中的氨氮和总氮,还具有生长代谢速度快、脱氮效率高、脱氮条件简单、污染物耐受浓度高等显著优势,是近年来废水处理领域研究的热点。本研究从化工废水、养殖沼液中筛选高效HN-AD菌,并针对在高氨氮、高盐和低温等极端环境下微生物的生长代谢会受到抑制的问题开展研究,同时考察了HN-AD菌在极端环境下的脱氮潜力和特性,探究HN-AD菌在极端环境下的生长代谢机制和脱氮机理。以期为HN-AD菌的实际应用提供理论指导。取得的结果如下:1.成功筛选得MS-275价格到两株HN-AD菌。通过形态学观察和16S r DNA序列的系统发育分析,分别鉴定为鞘氨醇盒菌Sphingobio-mediated synthesispyxis sp.和不动杆菌Acinetobacter sp.,命名为Sphingopyxis sp.CY-10和Acinetobacter sp.TAC-1。考察了两株菌的异养硝化和好氧反硝化特性,菌株CY-10和TAC-1对高浓度氨氮表现出良好的耐受能力和去除率,在初始氮素浓度为300mg/L时,5天内CY-10对氨氮去除率达100%,TAC-1对氨氮去除率达95.8%,两株菌对COD去除率均能达90%以上,具有良好的异养硝化功能。菌株CY-10对硝态氮和亚硝态氮(300mg/L)的去除率最高分别达91.1%和68.5%;菌株TAC-1对硝态氮和亚硝态氮(300mg/L)去除率最高分别达95.3%和45.8%,表现出好氧反硝化功能。菌株CY-10是目前首株被发现具有异养硝化和好氧反硝化功能的鞘氨醇盒菌Sphingopyxis sp.。2.在不同培养条件下考察菌株CY-10和TAC-1的脱氮性能,探究菌株生长及脱氮的最佳条件。在初始氨氮浓度为300 mg/L,接种量为2%,转速为170 rpm,C/N为10的条件下,菌株CY-10和TAC-1表现出的脱氮效率是最高的,且最佳碳源均为琥珀酸钠。菌株TAC-1生长及脱氮最适盐度为0%,而菌株CY-10能够耐受高盐环境,在盐度为0-5%范围内氨氮去除率均可以达90%以上,最高耐受盐度可达6%,在盐度为5%时,菌株最大OD_(600)达2.136,NH_4~+-N去除率为92.3%。菌株CY-10生长脱氮的最适温度为30℃,而菌株TAC-1能够耐受低温环境,菌株TAC-1在5℃至30℃的温度范围内,培养基中氨氮近乎全被利用,去除率均接近100%。其光密度值(OD_(600))在温度为5℃的条件下,最高可达2.31,NH_4~+-N去除率达94.6%。菌株CY-10和TAC-1在极端环境中表现出了良好的脱氮潜力。3.利用代谢组学探究了菌株CY-10在高盐条件下的生长和代谢机理。高盐和无盐两组代谢组质谱数据比较显示,在阳性和阴性模式下具有显著性差异的代谢物有130种。蔗糖和D-塔格糖在高盐条件下显著上调,这些亲和溶质的积累可以补偿高盐环境中细菌细胞内外渗透压的失衡,缓解细胞的压力,调节渗透压,从而使菌株CY-10在高盐环境下能够维持细胞的正常代谢活动。在高盐条件下,4-亚甲基-L-谷氨酰胺、甲硫酰天冬酰胺、4-甲基咪唑和谷氨酰胺的含量显著高于对照组无盐条件,这四种代谢物差异权重贡献值最大,可以推断菌株CY-10在高盐条件下的生长脱氮机制与这selleck抑制剂些代谢产物密切相关。4.通过荧光定量PCR技术推测菌株CY-10的氨氮代谢途径。成功扩增出了菌株CY-10的脱氮功能基因(amo A,hao,nap A,nir S,nir K和nos Z),并在RNA水平探究了上述基因在好氧条件下的表达量。菌株CY-10中氨单加氧酶amo A平均基因表达量为3.07×10~7copies/g,羟氨氧化酶hao平均基因表达量1.65×10~3copies/g,周质硝酸盐还原酶nap A平均基因表达量为4.93×10~8copies/g,亚硝酸盐还原酶nir S和nir K平均基因表达量分别为1.59×10~6copies/g和1.18×10~9copies/g,NO还原酶nor B基因和N_2O还原酶nos Z基因的平均表达量分别为1.97×10~7copies/g和2.70×10~8copies/g,在基因层面上说明菌株CY-10脱氮过程中的最终产物为N_2,是一种环境友好型的微生物。结合菌株CY-10对不同氮源的去除研究结果,推测菌株CY-10的氨氮异化途径为NH_4~+-N→NH_2OH→NO_2~–N→NO→N_2O→N_2。5.通过转录组学和荧光定量PCR技术探究了菌株TAC-1在低温下的脱氮机制。菌株TAC-1在低温5℃时,氨氮、硝态氮和亚硝态氮(300mg/L)去除率分别为94.6%,93.3%和42.4%。根据转录组差异表达基因发现菌株TAC-1在低温5~oC条件下的响应机制主要是有多个ABC转运蛋白和脂肪酸去饱和酶基因表达上调,为微生物在低温下能够正常生长代谢提供了足够的营养物质、保护物质和金属离子,增加生物膜流动性从而提高生物体的抗冻性。此外,通过转录组分析还发现与谷氨酸脱氢酶脱氮通路相关的基因gln A和glt B显著上调,与硝酸盐还原相关的nar K和与亚硝酸盐还原相关的基因nir B显著上调。在不同初始氮源条件下,成功扩增出菌株TAC-1的nar G,nir S和nir K基因。推测在菌株TAC-1的作用下,氨氮可以通过同化作用转化为细胞内氮,通过异化作用转化为气态氮。结合菌株转录组基因表达及对不同氮源的去除结果,推测菌株TAC-1的氨氮异化途径为NH_4~+-N→NH_2OH→NO_2~–N→NO_3~–N→NO_2~–N→NO→N_2O→N_2。本文的研究结果可为高氨氮、高盐和低温废水的处理提供新思路和新菌源,也可以为极端环境下HN-AD菌的应用和脱氮机理的研究提供理论指导。