双歧杆菌是一种广泛存在于人类肠道中的有益菌,被广泛用于益生菌制剂的开发。然而双歧杆菌中的青春双歧杆菌和两歧双歧杆菌发酵密度低,冻干活性差,产业化成本较高。前期的研究表明,双歧杆菌的发酵浓度和冻干活性可能与其耐渗透压能力有关,因此本研究筛选耐高渗的青春双歧杆菌和两歧双歧杆菌,验证其是否具有较高的发酵密度和冻干活性,在此基础上进一步优化培养基组分和发酵工艺;并解析耐高渗菌株在盐诱导的渗透压胁迫下的适应机制,基于以上机制通过改变培养条件以及添加外源物质进一步提高耐高渗菌株的发酵密度和冻干存活率。本研究提供了可高效产业化的青春双歧杆菌与两歧双歧杆菌及对应的高密度培养方法,对其生产和应用都具有重要意义。本研究的主要研究结果如下:(1epigenetic factors)通过不同梯度高盐液体培养基对94株青春双歧杆菌与85株两歧双歧杆菌进行耐渗性分析。结果表明,大部分两歧双歧杆菌与青春双歧杆菌在渗透压为900m Osm/kg(1.8%Na Cl)时生长就完全被抑制,而两歧双歧杆菌CCFM1301和CCFM1163可耐受渗透压达1400 m Osm/kg(3.3%Na Cl),青春双歧杆菌CCFM1302和CCFM1066可耐受渗透压达1500 m Osm/kg(3.6%Na Cl),且耐渗透压能力能稳定遗传。(2)通过测定双歧杆菌利用不同类型氮源与微量元素的代时与最大生物量,确定最适培养基组分,并进一步分析菌株在生长速率被抑制时的碳氮消耗比、不同浓度微量元素及最适生长p H值,确定最优培养工艺。结果表明,青春双歧杆菌的最优氮源是胰酪蛋白胨与酵母浸粉FM528的复合物,两歧双歧杆菌的最优氮源为胰酪蛋白胨;双歧杆菌限制性微量元素是Mg~(2+),最终生长密度与Mg~(2+)浓度在一定范围内呈正相关。以生长速率被抑制时的碳氮消耗比为培养基的碳氮浓度比,以菌株生长被完全抑制时渗透压推算初始底物浓度得到的青春双歧杆菌CCFM1302和CCFM1066的最适培养基分别为:葡萄糖56.9 g/L、复合氮源21.0 g/L;葡萄糖56.5 g/L、复合氮源22.4 g/L,此外添加Mg SO_4·7H_2O 0.25 g/L,半胱氨酸1 g/L、吐温80 1 m L/L,在恒p H5.5培养至稳定期发酵液最高活菌数为(20.7±1.2)×10~9、(17.1±1.3)×10~9CFU/m L,较传统MRS培养提高了20-30倍,较普通青春双歧杆菌CCFM8630提高了2倍;冻干存活率为(31.42±4.24)、(29.43±2.43)%,较普通青春双歧杆菌CCFM8630提高了2倍。两歧双歧杆菌CCFM1301和CCFM1163的最适培养基分别为:葡萄糖49.5 g/L、胰酪蛋白胨32.1 g/L;葡萄糖48.4 g/L、胰酪蛋白胨35.8 g/L;此外添加Mg SO_4·7H_2O 1.25 g/L,半胱氨酸1 g/L、吐温80 1 m L/L,在恒p H6.0培养至稳定期发酵液活菌数最高可达(9.4±1.0)×10~9、(7.5±0.4)×10~9CFU/m L,较传统MRS培养提高了25-30倍,较普通两歧双歧杆菌CCFM16提高了3倍;冻干存活率为(45.40±2.42)、(46.23±4.56)%,较普通两歧双歧杆菌CCFM16提高了1.2倍。(3)以耐高渗的青春双歧杆菌CCFM1302、两歧双歧杆菌CCFM1301及不耐高渗的青春双歧杆菌CCFM8630和两歧双歧杆菌CCFM16为研究对象,通过ICP-MS和GC-MS分析不同菌株在应对不同渗透压环境时对钾钠离子的摄取、细胞膜脂肪酸与胞内物质组成,研究各菌株渗透压胁迫下的适应机制。结果发现,在最初受到渗透压胁迫时,耐高渗青春双歧杆菌和两歧双歧杆菌较不耐高渗菌株能够较快响应渗透压的变确认细节化,通过摄入大量K~+以平衡细胞内外渗透压差;在胁迫后期,所有菌株的细胞膜不饱和脂肪酸含量均提高,且耐高渗与不耐高渗菌株无显著差异,但耐高渗的青春双歧杆菌CCFM1302和两歧双歧杆菌CCFM1301的环丙烷脂肪酸含量为24.96±0.38、22.89±1.31,显著高于不耐高渗菌株;在胞内物质积累方面,不耐高渗的青春双歧杆菌只有三种氨selleck激酶抑制剂基酸的显著提高:谷氨酸(3.07倍)、精氨酸(4.22倍)、脯氨酸(19.18倍),而耐高渗的青春双歧杆菌发现多种相容性溶质的显著积累:脯氨酸(19.04倍)、苏氨酸(6.25倍)、丙氨酸(4.19倍)、天冬氨酸(12.42倍)、天冬酰胺(5.83倍),且发现柠檬酸含量显著提高(12.79倍);不耐高渗的两歧双歧杆菌以谷氨酸积累为主:谷氨酰胺(3.84倍)、谷氨酸(14.34倍),而耐高渗的两歧双歧杆菌未发现显著的氨基酸积累,但柠檬酸(21.07倍)、棕榈油酸(C16:1)(1.50倍)及环丙烷脂肪酸(2.05)水平显著增加。表明脯氨酸等相容性溶质的积累,及以柠檬酸代谢流合成细胞膜脂肪酸在耐高渗青春双歧杆菌响应渗透压的过程中起到了重要的作用;而合成不饱和脂肪酸如环丙烷脂肪酸是耐高渗两歧双歧杆菌响应渗透胁迫的关键机制。(4)基于上述青春双歧杆菌和两歧双歧杆菌渗透压胁迫下的适应机制进一步通过发酵控制提高培养密度和冻干存活率的有效方法有:将Na OH和KOH溶液以体积比1:1混合作为恒p H分批培养的中和剂,在培养基中添加500μg/m L的β胡萝卜素、14g/L的谷氨酸、7 g/L的脯氨酸(仅青春双歧杆菌)。