目的:筛选临床收集的耳-下颌发育不全综合征五代大家系的高危致病基因,构建候选基因斑马鱼变异模型,通过观察斑马鱼胚胎下颌发育的表型,验证候选基因的功能,对该病的发病机制进行深入的探索。方法:对耳-下颌发育不全综合征家系中的先证者及相关成员进行全外显子组测序,测序结果经过变异频率的比对、功能变化的注释和致病性的预测等生物信息学分析过程,筛选出可疑的高危致病基因。本课题采用RT-PCR及斑马鱼整胚原位杂交技术,得到候选基因的斑马鱼同源基因在斑马鱼胚胎发育过程中的时间及空间表达情况。运用CRISPR/Cas9快速表型筛选系统敲除斑马鱼中的同源基因,通过体式显微镜动态观察斑马鱼幼鱼的颌面软骨,并对斑马鱼胚胎进行阿尔辛兰软骨染色及小麦胚芽凝集素(WGA)软骨膜染色,可直观看到斑马鱼颌面软骨发育的状况。通过胚胎抗体免疫荧光染色方法来检测斑马鱼胚胎发育过程中神经嵴细胞的增殖、凋亡以及特异性抗体的表达情况。体外合成斑马鱼神经嵴细胞发育过程中几个重要标志基因的原位杂交探针,对不同时期的斑马鱼胚胎进行整胚原杂染色,研究候选基因在颌面软骨发育过程中的作用机制。结果:耳-下颌发育不全综合征家系全外显子组测序结果提示FBLN2基因为该家系的高危致病基因。斑马鱼同源基因原位杂交实验结果发现fbln2在早期斑马鱼胚胎Torin 1配制发育过程中持续表达,并在下颌软骨区域特异CP-690550浓度性高表达。利用CRISPR/Cas9快速表型筛选系统敲除斑马鱼fbln2基因,可观察到斑马鱼下颌软骨发育畸形。阿尔辛兰软骨染色和WGA染色结果提示,敲除fbln2基因,斑马鱼第一咽弓和第二咽弓发育而来的软骨形态及结构畸形,角腮软骨结构畸形,严重者甚至消失。咽囊发育相关的标志基因fgf3、nkx2.3的原杂结果提示,敲除fbln2基因的突变体胚胎咽囊的发育与对照组相比无明显差异。动态观察Tg(flila:EGFP)转基因背景下fbln2突变体胚胎咽弓发育情况,突变体咽弓的形成以及结构未发现显著异常。crestin、foxd3、barx1原位杂交结果提示,fbln2突变体胚胎颅面神经嵴细胞的形成、聚集并未受到严重影响。sox9a、col2a1a原位杂交结果提示,Fibulin-2功能缺失引起斑马鱼下颌软骨分化受阻。TUNEL凋亡染色提示,Fibulin-2功能缺失可引起斑马鱼胚胎发育早期神经嵴细胞的凋亡增加。WGA软骨细胞膜染色结果提示,敲除fbln2基因引起斑马鱼胚胎下颌软骨细胞形态变化,同时出现软骨细胞排列紊乱。PHH3抗体免疫荧光染色结果提示fibulin-2功能缺失可能影响早期胚胎神经嵴细胞的增殖过程,p-smad1/5/8抗体染色结果提示fibulin-2功能缺失引起斑马鱼胚胎BMP信号通路异常下调。结论:FBLN2基因是耳-下颌发育全综合征家系的高危致病基因。斑马鱼胚胎中Fibulin-2功能缺失可能通过影响BMP信号通路,引起胚胎发育早期神经嵴细胞的凋亡增多、增殖减少,并且神经cancer epigenetics嵴细胞分化为软骨细胞的过程受阻、下颌软骨细胞的排列受到影响,最终出现下颌软骨发育畸形。