研究背景及研究目的:EV-D68是小核糖核酸病毒科肠道病毒属的一种新兴病原体,于1962年首次从四名因严重急性下呼吸道疾病住院的儿童咽拭子中分离并鉴定。EV-D68是一种小型、无包膜二十面体病毒,基因组为一个约7.4 kb的正义单链RNA。EV-D68的生物学特征与传统肠道病毒不同,包括对酸敏感,喜欢较低的生长温度,在呼吸道中增殖,以及主要通过呼吸道而不是通过粪口途径传播。尽管在EV-D68被鉴定之后的40余年中,全球仅报道了26个零星散发病例,但在2005年以来,它经历了全球性暴发性增长,更于2014年在美国发生了感染大暴发,此后以季节性、两年一次的模式发生感染。鉴于此,EV-D68感染已经成为严重的公共卫生事件。EV-D68感染除引起轻度到重度的呼吸道疾病以外,更为重要的是与各种中枢神经系统并发症关系密切,在这其中以AFM报道最多。AFM是一种主要发生在儿童中的麻痹性疾病,与脊髓灰质炎有惊人的相似之处。表现为患肢僵硬或疼痛,之后出现神经反射减弱或缺失,如累及更为广泛的肢体,将出现四Emricasan供应商肢瘫痪,虽然患肢不会发生肌肉萎缩,但会遗留明显的肌无力症状。然而,EV-D68导致神经毒性的机制仍不清楚。因此,阐明EV-D68毒性机制对于开发新的策略来预防EV-D68感染非常重要。TDP-43蛋白是一种普遍表达的hn RNP,由1号染色体的TARDBP基因编码。该蛋白于1995年以一种能够抑制人类免疫缺陷病毒1型(human immunodeficiency virus type 1,HIV-1)基因表达的细胞因子被首次鉴定,并于2006年发现其是FTLD和ALS患者神经细胞胞质中异常蛋白聚集的主要成分。TDP-43在RNA剪接、转录、m RNA运输和稳定过程中发挥重要生理功能,并调节mi RNA的生物发生。TDP-43在正常生理条件下主要定位于细胞核,这是其发挥生理功能的前提。但在病理情况下,TDP-43会转移到细胞质中,经历多种翻译后修饰,包括磷酸化、泛素化和切割,导致其在胞质中的积累。TDP-43的异位分布和聚集是许多神经退行性疾病的共同特征,包括阿尔茨海默病等。因此,我们在本研究中旨在分Safe biomedical applications析EV-D68感染对呼吸道及神经细胞中TDP-43切割、亚细胞定位和致病性聚集的影响,以期为EV-D68发病机制提供新的证据。研究方法:1.EV-D68感染对TDP-43的影响。(1)EV-D68感染对TDP-43定位的影响:在HEK293T细胞中过表达产生TDP-43-m Cherry融合荧光蛋白的pm C1-m Cherry-TDP-43质粒,转染后24 h应用EV-D68(MOI=0.04)感染细胞,并于24 h后进行荧光成像。为了进一步证实研究结论,于T98G细胞中用EV-D68(MOI=0.08)进行感染,48 h后将细胞固定进行免疫荧光成像。(2)EV-D68感染对TDP-43的切割作用:在HEK293T细胞中进行EVD68(MOI=0.04)感染,24 h后收获细胞样品通过免疫印迹分析TDP-43的蛋白表达。随后在呼吸道细胞A549、BEAS-2B及神经细胞T98G、SH-SY5Y细胞中进行EV-D68感染(MOI分别为0.008和0.08),收获细胞样品后进行免疫印迹分析。为了排除caspase系统激活在EV-D68感染诱导TDP-43切割过程中发挥的作用,应用caspase抑制剂Z-VAD抑制caspase活性以明确EV-D68对TDP-43的切割作用。(3)EV-D68感染对TDP-43溶解度的影响:在HEK293T细胞中过表达TDP-43全长和截短体蛋白,72 h后收获细胞样品,应用RIPA和尿素缓冲液顺序提取细胞蛋白并进行免疫印迹分析。同样实验方法下于转染后48 h进行免疫荧光,通过激光共聚焦显微镜观察TDP-43全长及截短体蛋白的亚细胞定位。2.EV-D68感染对TDP-43蛋白影响的作用机制。(1)在HEK293T细胞中共表达pm C1-m Cherry-TDP-43与EV-D68非结构蛋白2A、2B、2C、3A、3C及3D,转染后48 h进行荧光成像,明确EV-D68非结构蛋白在TDP-43亚细胞定位中发挥的作用。(2)在HEK293T细胞中共转染HA-TDP-43与EV-D68结构蛋白及非结构蛋白质粒,48 h后收获细胞样品进行免疫印迹分析,鉴定EV-D68中何种组分介导了TDP-43的病理性切割。(3)对EV-D68 3C蛋白酶已知切割位点进行序列标识分析,根据分析结果构建TDP-43点突变体;将3C与TDP-43突变体表达载体共转染,48 h后进行免疫印迹分析考察3C蛋白酶的切割位点。3.病理性TDP-43的细胞毒性作用。(1)在HEK293T和T98G细胞中瞬时转染TDP-43全长蛋白及TDP-43截短体蛋白,72 h后收取细胞培养上清,通过检测乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)释放衡量细胞毒性作用。(2)在HEK293T细胞中瞬时转染3C,并应用3C样蛋白酶抑制剂GC376处理细胞,72 h后检测培养上清LDH释放。4.通过新药候选系统筛选靶向3C酶活性的抗EV-D68药物。在HEK293T细胞中应用EV-D68感染,并用两种候选药物洛匹那韦及奈非那韦处理细胞,24 h后通过免疫印迹分析检测TDP-43的表达情况。5.TDP-43对EV-D68复制的影响。于A549细胞和T98G细胞中转染靶向TDP-43 m RNA的特异性si RNA,下调TDP-43蛋白表达量,24 h后用EV-D68(MOI分别为0.008及0.08)进行感染。于感染后48 h收获细胞样品进行免疫印迹分析,另收获培养上清进行子代病毒滴度测定。结果:1.EV-D68感染导致TDP-43胞质异位、切割和聚集。(1)在感染EV-D68的HEK293T及T98G细胞中,与未感染的细胞相比较,TDP-43的亚细胞定位自细胞核异位至细胞质中,并于细胞质中形成点状聚集。(2)在HEK293T、A549、BEAS-2B、T98G及SH-SY5Y细胞中,EVD68感染将TDP-43切割为35 k Da的病理性截短体;应用Z-VAD抑制caspase酶活性后不影响EV-D68诱导的TDP-43切割作用。(3)于HEK293T细胞中过表达TDP-43全长及截短体蛋白的细胞分级分离结果显示,TDP-43截短体蛋白主要分布于RIPA不溶性组分中,提示其溶解度下降。免疫荧光结果亦表明,与分布于细胞核中的TDP-43全长蛋白相比较,TDP-43截短体蛋白异位至胞质中并形成点状聚集。2.EV-D68 2A及3C蛋白酶分别介导了TDP-43的胞质异位、切割和聚集。(1)EV-D68非结构蛋白与pm C1-m Cherry-TDP-43共转染后,于2A与TDP-43共转染细胞中观察到TDP-43自核内异位至胞质中。(2)EV-D68结构蛋白及非结构蛋白与HA-TDP-43共转染后,免疫印迹分析结果显示过表达3C将TDP-43切割为35 k Da的截短体。(3)根据3C蛋白酶已知切割位点的序列标识分析,我们构建了TDP-43点突变体TDP-43-Q327L及TDP-43-Q331A,在表达野生型及突变体TDP-43的HEK293T细胞中共转染EV-D68 3C或感染EV-D68,免疫印迹分析结果显示TDP-43-Q327L无法被EV-D68和3C蛋白酶切割。证实EV-D68在TDP-43的Q327残基处诱导切割。3.TDP-43截短体具有细胞毒性作用。(1)与过表达TDP-43全长蛋白相比较,在过表达TDP-43截短体蛋白的HEK293T和TBaf-A1纯度98G细胞培养上清中LDH释放显著增加,提示TDP-43截短体具有明显的细胞毒性作用。(2)过表达3C具有显著的细胞毒性,GC376的应用抑制了3C蛋白酶的细胞毒性作用,显著恢复了细胞活力。4.洛匹那韦显著抑制了3C诱导的TDP-43切割,提示其能够通过靶向3C酶活性作为抗EV-D68感染的新型候选药物。5.敲低TDP-43不影响EV-D68的复制。于A549细胞和T98G细胞中应用靶向TDP-43 m RNA的si RNA转染致TDP-43蛋白表达显著下调,感染EV-D68之后的免疫印迹分析结果显示EVD68病毒结构蛋白VP1的表达与对照组细胞没有差异,上清中子代病毒的滴度与对照组亦无差异。结论:1.EV-D68感染导致TDP-43细胞质异位、切割及聚集,其中病毒2A蛋白酶介导TDP-43的胞质异位,3C蛋白酶介导TDP-43的切割及聚集;2.3C介导的TDP-43切割依赖于其蛋白水解酶活性,并在Q327残基处切割TDP-43;3.3C介导的TDP-43切割产物具有细胞毒性,GC376能够通过阻断3C酶活性进而改善3C介导的细胞毒性作用,提示3C可作为治疗其所诱导细胞毒性的潜在靶点;4.洛匹那韦能够抑制3C介导的TDP-43切割,在通过直接抑制3C的酶活性来控制EV-D68大流行方面具有潜在的应用价值;5.TDP-43的表达水平不影响EV-D68病毒复制。