研究背景:肿瘤免疫是宿主运用自身的免疫系统识别并清除肿瘤细胞,从而使宿主免于罹患肿瘤。然而,肿瘤细胞在不断扩增自身的同时,持续驯化机体免疫系统,导致肿瘤微环境(Tumor microenvironment,TME)中的免疫细胞走向免疫抑制而丧失清除肿瘤细胞的作用。例如肿瘤微环境中持续性肿瘤抗原刺激、慢性炎症和缺氧等诱导肿瘤浸润性CD8~+T细胞高表达程序性死亡受体-1(Programmed cell death-1,PD-1),与肿瘤细胞、肿瘤相关抗原提呈细胞表面程序性死亡配体-1(Programmed cell death ligand-1,PD-L1)结合导致TZD1839体外细胞功能障碍。以靶向PD-1/PD-L1为代表的免疫检查点阻断(Immune checkpoint blockades,ICB)疗法则可以重启功能失调的CD8~+T细胞,发挥抗瘤作用。目前临床数据发现抗PD-1/PD-L1治疗在一部分肿瘤患者中取得巨大成功。但是仍然有大部分肿瘤患者无法从ICB治疗中获益。提示我们需要深入研究响应ICB治疗的CD8~+T细胞群体。CD8~+T细胞浸润到肿瘤微环境中对于抗PD-1/PD-L1治疗发挥疗效至关重要。然而,肝癌和非小细胞肺癌中肿瘤浸润性CD8~+T细胞的单细胞RNA测序(Single-cell RNA sequencing,sc RNA-seq)结果显示CD8~+T细胞具有高度异质性。越来越多的证据也表明,肿瘤浸润性CD8~+T细胞异质性是阻碍抗PD-1/PD-L1治疗疗效最大化的主要原因,对于异质性的肿瘤浸润性CD8~+T细胞群体不会产生同等的治疗效果。临床证据也表明,肿瘤浸润性CD8~+T细胞的不同亚群可作为预测抗PD-1/PD-L1治疗疗效的生物标志物。例如,在晚期黑色素瘤患者中,与终末耗竭T细胞相比,肿瘤浸润性TCF1~+CD8~+T细胞能够更好地控制肿瘤生长,并且它们在基线肿瘤组织中的丰度与抗PD-1治疗疗效呈正相关。相反,在非酒精性脂肪性肝病诱导的肝细胞癌的临床前模型中,PD-1抑制剂治疗却导致肿瘤负荷增加,与肝CD8~+PD-1~+CXCR6~+TOX~+TNF~+T细胞浸润增加相关。目前为止,对于影响抗PD-1/PD-L1治疗疗效的肿瘤浸润性CD8~+T细胞不同亚型的研究尚不明确。CD8~+T细胞不同亚群的功能状态主要是根据免疫检查点分子的表达来区分。例如,PD-1和T细胞免疫球蛋白和黏蛋白3(T cell immunoglobulin and mucindomain-3,TIM-3)的共表达认定为终末耗竭期CD8~+T细胞亚群,其对PD-1阻断疗法几乎不响应。此外,外周血CD8~+T细胞上的淋巴细胞激活基因3(Lymphocyte-activation gene 3biological optimisation,LAG-3)表达预示患者对于抗PD-1治疗预后不良。在荷瘤小鼠模型中,肿瘤浸润性CD28~+CD8~+T细胞被证明对于抗PD-1治疗发挥疗效是必需的。基于以上研究,我们假设,根据各种免疫检查点分子的表达将肿瘤浸润性CD8~+T细胞细分为不同亚群可能进一步明确对PD-1/PD-L1疗法响应的CD8~+T细胞。本课题旨在探索新的对PD-1/PD-L1疗法响应的CD8~+T细胞新亚群,我们首先收集分析了公开的临床免疫治疗队列,治疗前后肿瘤浸润性T淋巴细胞sc RNA-seq数据,发现抗PD-1治疗后CD200~+T细胞比例增加,进一步探索CD200~+T细胞比例扩增与抗PD-1/PD-L1治疗疗效的相关性。接下来通过构建小鼠肿瘤(MC38,LLC)模型,探究抗PD-L1治疗对肿瘤微环境中CD200~+T细胞、CD200~+细胞毒性T淋巴细胞(Cytotoxic T lymphocytes,CTLs)浸润比例的影响,进一步通过清除抗体明确CD200~+T细胞缺失对抗PD-L1治疗疗效有无影响;其次探究CD200~+CTLs的解剖学位置分布以及生物学功能;最后探究肿瘤微环境中CD200~+CTLs浸润程度与免疫治疗疗效以及生存预后的关系。本课题的以上发现,揭示了介导免疫治疗发挥疗效的CD8~+T细胞新亚群,解析了其发挥抗瘤作用的机理以及与免疫治疗患者疗效和生存预后的关系,为临床预测免疫治疗疗效及过继T细胞治疗提供新的策略。方法:1、探究CD200~+T细胞与肿瘤患者抗PD-1治疗的关系1.1收集整理公开的免疫治疗队列内T细胞sc RNA-seq数据和临床信息;1.2运用Wilcoxon秩和检验比较抗PD-1治疗前后各免疫检查点阳性T细胞比例变化情况;1.3比较CD200~+T细胞浸润程度与抗PD-1治疗疗效关系;2、动物模型验证CD200~+T细胞与抗PD-L1治疗的关系2.1构建MC38小鼠荷瘤模型,探究抗PD-L1治疗对CD200~+T细胞、CD200~+CTLs浸润比例影响;2.2探究CD200~+CTLs细胞缺失是否影响MC38荷瘤小鼠抗PD-L1治疗疗效;3、解析CD200~+CTLs的解剖学位置分布和生物学功能3.1检测肿瘤、引流淋巴结、脾脏、外周血中CD200~+CTLs比例;3.2检测肿瘤中CD200~+CTLs增殖能力;3.3检测肿瘤中CD200~+CTLs效应功能;3.4检测CD200~+CTLs体外特异性杀伤肿瘤细胞能力;4、分析CD200~+CTLs浸润程度与肿瘤患者IMCC950生产商CB治疗疗效及生存预后的关系4.1运用对数秩检验(log-rank test)和乘积极限法(Kaplan-Meier method)比较CD200~+CTLs高低浸润评分组患者生存时间(Overall Survival,OS)的差异;4.2运用单因素考克斯(univariate cox)模型评价CD200~+CTLs对免疫治疗患者预后的影响。结果:1、抗PD-1治疗后CD200~+T细胞在人肿瘤中浸润增加1.1免疫治疗队列sc RNA-seq数据提示抗PD-1治疗后CD200~+T细胞浸润比例增加;1.2 CD200~+T细胞比例较高的患者对抗PD-1治疗响应率更好;2、动物模型证实抗PD-L1治疗后CD200~+CTLs浸润增加,是有效的抗PD-L1治疗所必需的2.1 MC38小鼠荷瘤模型中,抗PD-L1治疗后CD200~+CTLs浸润增加;2.2 MC38小鼠荷瘤模型中,CD200~+CTLs缺失显著降低抗PD-L1治疗疗效和生存获益;3、CD200~+CTLs主要存在于肿瘤微环境中,有较强的抗肿瘤作用3.1检测发现CD200~+CTLs主要存在于肿瘤微环境中;3.2 CD200~+CTLs较CD200~-CTLs增殖能力更强;3.3 CD200~+CTLs较CD200~-CTLs有更强的效应功能;3.4 CD200~+CTLs较CD200~-CTLs有更强的特异性杀伤肿瘤功能;4、CD200~+CTLs浸润程度可以预测免疫治疗疗效4.1 CD200~+CTLs浸润程度较高的肿瘤患者生存预后更好;4.2 CD200~+CTLs浸润程度较高的肿瘤患者对免疫治疗响应率更高;结论:1、CD200~+T细胞在免疫治疗后浸润增加,与免疫治疗疗效正相关;2、CD200~+CTLs主要存在于肿瘤微环境中,有较强的肿瘤杀伤功能;3、肿瘤微环境中CD200~+CTLs高浸润可以预测免疫治疗疗效。