肿瘤标志物的检测对于疾病的早期诊断和疗效评估至关重要,但是肿瘤标志物在生物样本中通常以极低的丰度存在,因此亟需开发简单有效、快速灵敏的肿瘤标志物检测方法。等温扩增技术具有扩增效率高和反应条件温和的优点,广泛应用于检测各种肿瘤标志物。本论文以Flap核酸内切酶1(FEAnterior mediastinal lesionN1)和豆蛋白酶(LGMN)为研究模型构建了两种基于等温信号放大方法灵敏检测肿瘤标志物分子的生物传感器。具体研究内容如下:(1)我们发展了一种基于连接反应介导的超支化滚环扩增方法用于无标记灵敏检测FEN1。结构特异性核酸内切酶FEN1参与真核生物的多种基因组维持途径,包括碱基切除修复、DNA复制和端粒的维持。FEN1的异常表达与多种人类疾病有关。FEN1已成为疾病诊断和治疗的潜在生物标志物。在本工作中,挂锁探针与辅助探针杂交形成具有5′分枝的环形DNA底物,用于识别FEN1。FEN1存在时,环形DNA底物的5′分枝结构被FEN1切割,产生带有5′磷酸的挂锁探针,随后通过Taq DNA连接酶连接形成环形探针。该探针可作为模板,在Vent(exo-)DNA聚合酶、Lorlatinib分子量引物1和2存在的情况下启动超支化滚环扩增反应。扩增生成的不同长度的双链DNA片段可被SYBR Green I染色,产生增强的荧光信号。由于FEN1诱导裂解的高特异性和超支化滚环扩增反应的高扩增效率,该方法具有良好的特异性和高的灵敏度,检测限为1.51×10~(-6) U/μL。该方法可以在等温条件下进行,无需涉及昂贵的特异性抗体、荧光标记探针、复杂的纳米材料的合成、高精度温度循环和额外的分离步骤。此外,该方法还可用于筛选FEN1抑制剂和定量检测人类癌细胞中的FEN1活性,在临床诊断和药物发现方面都有着重要的潜在应用价值。(2)我们发展了一种基于磁分离和循环酶修复扩增的荧光生物传感器用于超灵敏检测LGMN。LGMN参与蛋白质的分解代谢、抗原呈递等多种重要的生命过程。LGMN的异常表达与多种人类疾病有关,因此迫切需要开发灵敏检测LGMN的新方法应用于相关肿瘤疾病的早期诊断。在本工作中,LGMN存在时,底物(DNA-肽缀合物)被LGMN特异性切割从而使DNA核苷酸暴露,成为一种触发DNA。磁分离后,产生的触发DNA与模板杂交,启动循环酶修复扩增反应。扩增产生的触发Roxadustat核磁链与信号探针杂交,随后Endo IV诱导裂解信号探针,释放大量的Cy3荧光分子,通过荧光检测可以简单地定量分析LGMN活性。检测方法灵敏度的提高得益于LGMN蛋白酶裂解的高特异性、循环酶修复扩增的高效率和Endo IV诱导的信号探针循环裂解反应。该方法的检测灵敏度高,不需要复杂的热循环过程就可以进行。此外,该方法可在单细胞水平上灵敏地检测结肠癌细胞中的LGMN含量,可进一步应用于LGMN蛋白酶抑制剂的筛选,在临床诊断和生物医学研究领域具有巨大的应用潜力。