下咽癌是一种较少见的头颈部恶性肿瘤,发病率约十万分之1.6(年龄标化发病率)。由于缺乏特异性的临床表现和有效的监测指标,下咽癌的早期诊断率较低。同时,该病还具有侵袭转移率高、对放化疗不敏感等特点,导致手术和放、化疗治疗效果不佳,预后不良,5年生存率仅为30%-35%。尽管近年来下咽癌放疗、新辅助化疗、免疫治疗及保留功能的手术治疗等技术取得了长足进展,但其发病率及死亡率与2018年和2012年相比未见明显下降。因此,了解下咽癌的发病机制,探索有效的预后指标和药物靶点,对提高下咽癌患者的诊断、治疗和预后具有重要意义。肿瘤相关成纤维细胞(CAFs)是肿瘤微环境中最重要的细胞成分之一,已有多项研究提示CAFs促进头颈鳞状细胞癌的转移、增加肿瘤血管生成、调节抗肿瘤免疫、介导对顺铂的耐药等,在肿瘤的发生发展中发挥重要作用,成为肿瘤研究的热点之一。胶原蛋白家族是细胞外基质的主要成员,主要由成纤维细胞分泌,可与TME中众多细胞成分及肿瘤细胞相互作用并发挥促肿瘤作用。作为胶原蛋白的主要受体,整合素介导细胞粘附并将机械和化学信号通过FAK等信号通路传递到细胞内部,促进肿瘤细胞增殖、EMT和肿瘤血管生成。高通量基因测序技术已经成为当前筛选肿瘤发生发展中多基因改变分子机制的重要工具,显著提高了癌症新靶标筛选效率。研究人员将组学数据与Compound 3分子量临床病理数据联合分析,为基础研究的临床转化、肿瘤的靶向治疗和联合治疗提供机会,提升了肿瘤精准诊断和治疗水平。目的:MRTX1133临床试验验证肿瘤相关成纤维细胞(CAFs)对下咽癌细胞恶性行为的促进作用。通过二代测序挖掘下咽癌CAFs与对应正常组织中成纤维细胞(NFs)的差异表达基因,观察CAFs表达的COL10A1对下咽癌细胞增殖、上皮间质转化(EMT)、血管生成拟态(VM)的作用及作用机制。方法:(1)遵循知情同意原则,收集吉林大学第一医院耳鼻咽喉头颈外科进行手术的下咽癌患者的新鲜组织,分离培养下咽癌组织中CAFs和癌旁正常组织中成纤维细胞(NFs)。观察二者增殖及传代情况;采用免疫印迹和免疫组织化学方法检测细胞因子表达情况;采用共培养方法观察CAFs和NFs对下咽癌细胞系FaDu增殖、迁移和侵袭能力的影响;采用免疫印迹方法检查CAFs对FaDu的EMT的影响。(2)提取CAFs和NFs的总RNA进行转录组测序,识别差异表达基因,构建差异基因共表达网络;识别并重聚类与临床特征相关的基因模块;对基因模块进行GO富集分析、构建PPI网络并鉴定HUB基因;在数据库中验证与下咽癌患者生存期密切相关的关键基因。(3)回顾78名下咽癌病例资料,分析其临床病理特征与关键基因之间的关系。CAFs转录组数据与分泌组学相印证挖掘下咽癌CAFs分泌组特点,并鉴定差异表达最明显且与临床病理相关的分泌蛋白编码基因COL10A1。采用双重荧光染色及免疫共沉淀检测下咽癌组织和高表达COL10A1的CAFs(CAF-H)、FaDu细胞中COL10A1及其受体的表达。(4)构建COL10A1过表达载体转染低表达COL10A1的CAF-L细胞得到稳定表达的CAF-L/OV细胞和转染空载体的CAF-L/Ve细胞;采用COL10A1si RNA寡核苷酸片段(oligo)转染高表达COL10A1的CAF-H细胞,分别用CAF-L/OV细胞和CAF-H/Si RNA细胞的培养基上清处理FaDu细胞,CCK8实验观察细胞活性、划痕实验检测细胞迁移能力。进行双向挽救验证COL10A1的生物学功能。(5)使用CAF-L/OV细胞和CAF-L/Ve细胞培养上清处理FaDu细胞,免疫印迹实验检测FaDu细胞中FAK蛋白及磷酸化FAK蛋白的表达变化,以及FAK下游蛋白ERK及其磷酸化的改变;免疫印迹实验检测FaDu细胞中与EMT相关的E-cadherin、N-cadherin、vimentin和Twist表达情况;检测FaDu细胞中与血管生成相关的PDGFR、VEGFA和VEGFR的表达情况;检测FaDu细胞中与血管拟态相关的MMP9、MMP14和VE-Cadherin的表达水平。最后在上述体系中加入FAK抑制剂,检测相关指标的变化。(6)CAF-L/OV、CAF-H/Si RNA和CAF-L细胞培养上清单独或与FAK抑制剂共同处理FaDu细胞或HUVEC细胞,三维管形成实验观察细胞管形成能力的变化。(7)CAFs-L/OV和CAFs-L细胞分别与FaDu细胞共同植入裸鼠体内,观察移植瘤体积变化情况,免疫组织化学染色检测移植瘤中新生血管和血管生成拟态形成情况。结果:(1)原代培养CAFs表达α-SMA、FAP、Vimentin、S100、CD90等间质细胞标记;高表达IL6、IL8,在体外促进FaDu细胞增殖、迁移和侵袭能力,下调E-cadherin表达,并促进FaDu细胞中N-cadherin、Vimenin和转录因子Snail、Twist的表达。(2)通过转录组测序识别CAFs和NFs中差异表达基因2538个,聚类成7个基因模块,其中与肿瘤T、N分期密切相关的M2、M3模块主要富集在细胞信号传导、细胞骨架和细胞迁移、血管生成等与肿瘤侵袭、进展相关的生物学过程。鉴定出ACTB、FAU、ITGA8、THBS1、IL-6、RPL11、SOCS1等七个与头颈鳞癌患者的生存时间高度相关的关键基因。并在78例下咽癌病例队列中验证ITGA8、IL6表达升高与更差的T分期和更差的分化程度相关。(3)通过CAFs转录组与分泌组数据及临床病理因素共同筛选出COL10A1基因,通过双重荧光染色及免疫共沉淀确认COL10A1与ITGA11相互作用。CAFs-L/OV细胞系促进FaDu增殖、迁移,激活FAK/ERK磷酸化,并进一步促进下咽癌EMT、血管生成和血管生成拟态(VM)相关因子表达。并且这些促进作用可被FAK抑制剂逆转。(4)高表达COL10A1的CAFs在体内促进下咽optical biopsy癌移植瘤的增殖、血管生成和血管生成拟态(VM)。结论:(1)CAFs在体外促进FaDu细胞增殖、迁移、侵袭和EMT;在体内促进下咽癌移植瘤的增殖、血管生成和血管生成拟态(VM)。(2)COL10A1是下咽癌CAFs中差异表达最明显的分泌蛋白,与FaDu细胞的ITGA11整合素结合发挥生物学作用。(3)COL10A1通过FAK/ERK信号通路促进下咽癌细胞EMT、血管生成和血管生成拟态(VM)。