研究背景:胆管癌(cholangiocarcinoma,CCA)是一种起源于胆道上皮的恶性肿瘤,其具有高度的侵袭性,可发生于胆道树以及肝实质内的任何部位。同时,肿瘤也可能由胆管周围腺体和肝细胞发展而来。胆管癌依据原发性解剖亚型进行分类,可分为肝内胆管癌(intrahepatic cholangiocarcinoma,iCCA)、肝门部胆管癌(perihilar cholangiocarcinoma,pCCA)以及远端胆管癌(distal cholangiocarcinoma,dCCA)三类亚型,每种肿瘤亚型有其独特的发病机制、临床特征、治疗手段以及预后特点。近年来,胆管癌在我国的发病率及死亡率均逐年升高。胆管癌的治疗选择非常有限,早期诊断困难,放化疗等辅助治疗均不敏感,预后极差,外科切除仍是首选的治疗方案。但大多数胆管癌患者在就诊时由于已存在远处转移或局部肿瘤进展至晚期,涉及的解剖结构十分复杂而不适合行手术切除。在临床工作中,仅有1/5的胆管癌患者在就诊时符合手术条件。但即便患者符合根治性切除的手术指征,行胆管癌根治性切除后,其5年的总体生存率仍低于10%。当前,与其他类型肿瘤相比,胆管癌的精准诊断与精确治疗远远落后,诊断治疗的分子生物标志物匮乏。虽然已经出现了锚定FGFR2融合基因或突变的靶向药物培米替尼(Pemigtinib,INCB054828),但相比于拉丁裔,亚裔中FGFR2融合的胆管癌患者占比低于20%,药物治疗痛点尚未触及。当前,如何通过对胆管癌患者的胆汁进行检测来预测肿瘤预后,指导个体化治疗的研究很少。本研究中,我们进行了胆汁小分子代谢组学的研究,并确定了肥大细胞(mast cells,MCs)来源的组胺(histamine,HA)是胆管癌患者预后不良的生物标志物。通过对临床胆管癌患者根治术后的肿瘤组织进行单细胞转录组学测序(scRNA-seq),我们证明了组胺1型受体(histamine receptor H1,HRH1)主要在肿瘤细胞中表达,组胺2型受体(histamine receptor H2,HRH2)则主要在肿瘤相关成纤维细胞中表达(cancer-associated fibroblasts,CAFs)。总而言之,在肿瘤胆汁中异常升高的组胺,提示着不良的预后结局。此外,组胺可以通过激活HRH1-Gαq信号,激活胆管癌细胞内的增殖信号。研究目的:1.基于胆汁非靶向小分子代谢物质谱检测,筛选胆管癌(CCA)及良性胆总管结石(calculusofcommonbileducts,CBDS)患者胆汁中的差异化合物,寻找CCA患者体液检测的潜在生物标志物,明确其诊疗价值。2.对CCA患者组织微阵列芯片(tissue microarray,TMA)进行甲苯胺蓝染色(toluidine blue staining),明确CCA胆汁中高浓度HA的来源。3.基于CCA和CBDS患者有创获取的胆汁及血清建立胆汁与血清库,检测胆汁差异代谢物组胺(histamine,HA)的表达水平,结合病人随访信息,分析胆道HA与肿瘤患者预后的关系。4.基于CCA肿瘤及肿瘤邻近组织的单细胞转录组学测序(scRNA-seq),明确HA受体在肿瘤微环境中各型细胞上的表达分布,寻找肿瘤细胞优势表达的受体。5.通过WB、qPCR、TMA的IHC染色及TCGA癌症数据库等多种途径,明确HRH1为CCA肿瘤组织与细胞中的优势受体。结合HRH1的IHC染色评分与患者术后随访,分析HRH1与肿瘤患者预后的关系。6.通过各种体内外实验,研究HA是否对CCA细胞有促增殖作用及深层的作用机制。研究方法:1.选取3例CCA患者胆汁及3例CBDS患者胆汁,对6例样本行非靶向小分子代谢组学检测,统计分析差异的正负离子,通过“热图”、“火山图”体现差异代谢物。2.收集遴选出2010年至2020年在山东大学齐鲁医院接受胆管癌根治性切除的282例患者的术后石蜡组织标本(包括iCCA 50例,pCCA HIV-related medical mistrust and PrEP113例,dCCA 119例),制作为组织芯片,行肥大细胞特异性甲苯胺蓝染色,并统计分析肥大细胞在CCA肿瘤及癌旁组织的分布情况。3.建立104例CCA患者及40例CBDS患者的胆汁及血清库,通过ELISA检测HA的表达水平,分析表达差异。利用ROC曲线计算CCA患者胆道HA与血清HA的cut-off 值,以便于将患者分为胆道或血清的 HA 高低亚组,通过生存分析和多因素分析,明确胆道HA对患者预后的影响,研究胆道HA是否为影响CCA患者预后的独立危险因素。4.收集新鲜的CCA肿瘤术后标本,包括3个pCCA组织、4个dCCA组织和4个肿瘤临近组织进行单细胞转录组学测序(scRNA-seq),并将这些数据与GEO数据库中的iCCA数据集(GSE ID:138709)进行整合,分析HA各型受体在CCA肿瘤及癌旁组织的各型细胞上的表达分布及差异,寻找CCA细胞的优势HA受体。5.通过WB、qPCR、TMA的IHC染色等实验方法及TCGA癌症数据库等生信分析手段,验证scRNA-seq结果,明确CCA细胞的优势HA受体。6.对CCA的TMA芯片行IHC-HRH1染色后评分,利用ROC曲线计算HRH1在iCCA、pCCA及dCCA的cut-off值,将患者分为HRH1高低表达亚组后结合随访信息,通过Kaplan-Meier法、long-rank检验、Cox回归模型进行生存分析及多因素分析,明确HRHI对患者预后的影响。7.通过绘制HA的药物剂量效应曲线,筛选HA的敏感细胞。使用siRNA及过表达质粒对CCA细胞的HRH1基因进行干扰或过表达后,通过CCK-8、集落形成实验检测HA对CCA细胞增殖的影响。8.通过bret检测HRH1-Gαq信号,通过WB检测Gαq下游的PKC(MARCKS及ERK)磷酸化水平,明确HA促CCA细胞的增殖机制。9.建立裸鼠皮下成瘤动物模型,探究HA在体内对CCA细胞增殖能力的影响。研究结果:1.CCA胆汁相较于CBDS胆汁,HA浓度显著上调,但HA浓度在血清中未表现出明显差异。2.TMA甲苯胺蓝染色及统计结果显示,CCA组织3-MA溶解度中MCs数量明显多于癌旁组织。3.高水平的胆道HA与CCA患者的不良预后显著相关,且HA可作为影响CCA患者预后的独立危险因素。4.scRNA-seq结果显示在CCA的肿瘤微环境中,组胺1型受体(HRH1)在CCA细胞上具有显著的表达优势,而HRH2在CAFs中表达上调。5.CCA组织或细胞系中HRH1的mRNA与蛋白水平均显著高于癌旁组织或正常胆管上皮细胞系。6.单因素生存分析结果显示,高表达的HRH1与三种亚型CCA患者的不良预后显著相关,多因素分析结果显示HRH1也可作为CCA患者预后的独立危险因素。7.CCA细胞为HA作用的敏感细胞,后者通过结合CCA细胞膜上的1型受体HRH1促进细胞的增殖能力。8.HA通过激活HRH1-Gαq信号,促进下游MARCKS及ERK的磷酸化,促进了CCA细胞增殖。9.在裸鼠皮下成瘤的动物模型中,HA能促进CCA细胞的增殖,而使用HRH1阻断剂特非那定(Terfenadine)特异性阻断HRH1后,HA的促肿瘤细胞增殖能力减弱。研究结论:1.HA作为CCA及CBDS患者胆汁的差异代谢物,在CCA胆道中的浓度显著上调,其可作为CCA患者体液检测的潜在生物Belumosudil标志物。2.高浓度的胆道HA与CCA患者的不良预后密切相关,为肿瘤预后的独立危险因素。3.在CCA肿瘤微环境中,HRH1为CCA细胞上优势表达的HA受体,且HA促CCA细胞增殖能力受HRH1表达的影响。4.HA通过激活HRH1-Gαq信号通路促肿瘤细胞增殖。