目的铁是人脑中最丰富的过渡金属。在健康成人大脑中铁的分布是不均匀的,在基底神经节中铁含量最高,而在灰质、白质、中脑和小脑中铁含量较低。随着年龄的增长,铁会沉积在大脑区域,如黑质(substantia nigra,SN)和苍白球。在各种神经退行性疾病中,如阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)和帕金森病(Parkinson’s Disease,PD),铁在特定大脑区域沉积,并且铁稳态失调。溶酶体作为铁代谢的主要调节器,在细胞铁转运和稳态中起着关键作用。有研究报道小鼠腹腔给铁后,肝脏和脾脏中铁水平升高。但腹腔给铁后,外周组织(如肝脏和脾脏)铁过载对溶酶体功能的影响,以及外周铁能否进入大脑区域影响溶酶体功能和运动功能需要进一步探讨。方法本实验建立腹腔注射葡聚糖铁(iron dextran,FeDx)小鼠模型,C57BL/6小鼠腹腔注射FeDx(200 mg/kg),对照组给予等量生理盐水,隔天一次,给药时长分别为1周、2周、3周或4周。应用免疫印迹法检测肝脏、脾脏、海马(hippocampal,HC)、纹状体(striatum,STR)、黑质和嗅球(olfactory bulb,OB)的L型铁蛋白(ferritin enriched in L subunits,L-ferritin)、酰基辅酶A合成酶长链家族成员4(Cyl-Co A synthetase long-chain family member 4,ACSL4)和谷胱甘肽过氧化物酶4(glutathione peroxidase 4,GPX4),同时检测了溶酶体相关蛋白的表达,如组织蛋白酶B(cathepsin B,CTSB)、组织蛋白酶D(cathepsin D,CTSD)、葡萄糖脑苷脂酶(glucocerebrosidase,GCase)、溶酶体整合膜蛋白2(lysosome integrated membrane protein 2,LIMP-2)和溶酶体相关膜蛋白1(lysosomal-associated membrCeralasertib使用方法ane proteins 1,LAMP-1)。应用铁含量测定试剂盒检测血清和脑脊液(cerebrospinal fluid,CSF)铁含量。应用免疫荧光染色和免疫组化染色检测多巴胺能神经元数量和纤维密度。应用步态分析评估小鼠的运动功能。结果1.腹腔注射FeDx 1周、2周、3周或4周后,与其对照组相比,肝脏和脾脏中L-ferritin水平显著升高,差异有统计学意义。肝脏和脾脏中ACSL4和GPX4蛋白水平在1-4周无显著差异。肝脏中CTSB、CTSD、GCase和LIMP-2蛋白水平在1-4周升高,差异有统计学意义。脾脏中CTSD、GCase和LIMP-2蛋白水平在1-4周升高,肝脏中CTSB蛋白水平在2-4周升高,差异有统计学意义。腹腔注射FeDx 1周后,肝脏中LAMP-1蛋白水平无明显变化,在2-4周时蛋白表达降低。结果提示,腹腔注射FeDx诱导小鼠肝脏和脾脏铁过载以及溶酶体功能障碍。2.腹腔注射FeDx 1周后引起血清铁浓度轻微升高,2-4周血清铁浓度随着给药周期而升高,差异有统计学意义。脑脊液中的铁浓度在1-4周时保持在定量限(limit of quantitation,LOQ)附近。结果提示,腹腔注射FeDx可导致血清铁浓度随时间依赖性升高,但脑脊液铁浓度没有明显升高。3.腹腔注射FeDx 1-2周,OB中L-ferritin蛋白水平升高,表明OB存在早期铁沉积,而HC和STR未观察到变化。腹腔注射FeDx 3-4周后,OB中L-ferritin蛋白水平下降至正常水平,HC和STR中L-ferritin蛋白水平升高。腹腔注射FeDx 3周或4周后,SN和STR的铁染色阳性细胞增加。结果提示,腹腔注射FeDx诱导OB、SN、HC和STR铁沉积。4.腹腔注射FeDx 1-4周,SN、HC和STR中CTSB和CTSD蛋白水平不变。腹腔注射FeDx 1-3周,OB中CTSB和CTSD蛋白水平保持不变,4周后OB中CTSB和CTSD蛋白水平下调,4周root canal disinfection后HC中LAMP-1蛋白水平降低。SN、HC、STR和OB中GCase和LIMP-2蛋白水平在1-4周无明显变化。结果提示,腹腔注射FeDx未引起OB、SN、HC和STR中明显的溶酶体功能障碍。5.经鼻给枸橼酸铁胺(Ferric ammonium citrate,FAC)两次后,OB中L-ferritin、CTSB、GCase和LIMP-2蛋白水平升高,CTSD和LAMP-1蛋白水平无显著差异。原代培养的腹侧中脑神经元/星形胶质细胞,经100μM FAC处理后,CTSB、CTSD、GCase、LIMP-2和LAMP-1蛋白水平无明显差异。原代培养的腹侧中脑神经元,经1 m M FAC处理后LIMP-2蛋白水平升高,而CTSB、CTSD、GCase和LAMP-1蛋白水平无显著差异。原代培养的腹侧中脑星形胶质细胞,经1 m M FAC处理后LIMP-2和LAMP-1蛋白水平升高,GCase蛋白水平无显著差异,CTSB蛋白水平升高。结果提示,FAC诱导OB和原代培养的腹侧中脑星形胶质细胞中CTSB表达上调,溶酶体功能受损。6.腹腔注射FeDx 4周后,STR中酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,TH)纤维密度和蛋白水平降低,而SN中TH阳性神经元的数目无明显差异。然而,虽然铁沉积首先出现在OB脑组织中,但OB中TH蛋白水平在1-4周无显著差异。结果提示,腹腔注射FeDx后引起黑质纹状体系统轻度损伤。7.腹腔注射FeDx后,小鼠静态步态指标发生了变化,最大接触面积、最大接触平均强度、步长、步宽和脚印面积等指标在不同的脚爪上出现了下降。然而,并未观察到任何显著的动态步态指标变化。结果提示,腹腔注射FeDx后不会引起明显的运动障碍。结论小鼠腹腔注射FeDx诱导肝脏和脾脏铁过载,OB、SN、HC和STR铁沉积。血清铁浓度随时间依赖性升高,但脑脊液铁浓度无明显升高。CTSB、CTSD、GCase和LIMP-2蛋白在肝脏和脾脏中显著上调,但在脑区无显著差异。急性铁过载OB和原代培养的腹侧中脑星形胶质细胞中CTSB表达上调。腹腔注射FeDxLY2157299抑制剂小鼠SN中多巴胺能神经元的数量保持不变,未引起明显的运动障碍。结果提示,腹腔注射FeDx诱导肝脏和脾脏铁过载以及溶酶体功能障碍,脑区(OB、SN、HC和STR)铁沉积,但不足以引起明显的溶酶体功能障碍和运动障碍。