第一部分:艾曲泊帕治疗慢性乙型肝炎相关血小板减少症的转录组变化分析研究背景:继发性血小板减少症在临床上比较常见,主要表现为自发性皮肤淤点、淤斑,以及齿龈、口腔粘膜、眼结合膜自发性的出血症状,常继发于自身免疫性疾病如系统性红斑狼疮和感染性疾病如人类免疫缺陷病毒感染、慢性肝炎病毒感染等。慢性乙型肝炎(Chronic hepatitis B,CHB)是由乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)持续感染引起的慢性肝病,目前世界上有2.96亿人受到慢性乙型肝炎的困扰,我国慢性乙型肝炎患者约8600万。慢性乙型肝炎患者血小板减少的患病率是17.7%,其携带者患病率是10.6%。研究证明血小板减少是慢性肝病预后不良的独立预测因子,其减少程度是肝硬化患者的早期预后标志。聚乙二醇-干扰素(Pegylated interferon,PEG-IFN)是慢性肝炎的重要治疗措施,慢性肝炎相关血小板减少症可能会影响聚乙二醇-干扰素的抗病毒治疗效果,因此在抗病毒治疗前及治疗中有效管理慢性肝炎患者的血小板数量对于开展和维持抗病毒治疗具有一定意义。目前国内没有针对慢性肝炎相关血小板减少症的临床治疗指南,其治疗方法主要参考原发性免疫性血小板减少症。研究表明,超过50%的慢性肝炎相关血小板减少症患者对糖皮质激素治疗有效,但长期使用糖皮质激素可能会使病毒复制趋于活跃,还可能引起肝脏损伤等不良反应;免疫球蛋白可以抑制HBV免疫反应,因此短时间应用可暂时升高血小板;对于对传统治疗方法反应不佳的慢性肝炎相关血小板减少症患者,可考虑脾切除治疗,但可能出现感染、门静脉血栓等风险。近年来,国内外大量研究逐步证实了 TPO在血小板生成过程中发挥的关键调控作用,因此促血小板生成素(Thrombopoietin,TPO)及其受体激动剂在治疗血小板减少中的临床作用和免疫机制也在被不断探索。艾曲泊帕(Eltrombopag,EP)是一种口服的小分子非肽类TPO受体激动剂。它与TPO受体的跨膜区域结合,激活细胞内信号转导通路,获悉更多诱导巨核细胞前体和巨核细胞增殖分化,从而增加血小板数量。研究显示艾曲泊帕可增加血小板减少的丙型肝炎患者、晚期纤维化和肝硬化患者的血小板数量,使因血小板水平不能接受治疗的患者能够启动和维持抗病毒治疗,显著提高持续病毒应答率(Sustained virological responMicroalgae biomassse,SVR)。目前国KPT-330试剂内外还没有关于艾曲泊帕治疗慢性乙型肝炎相关血小板减少症的临床试验发布,2012年发布的一项研究称艾曲泊帕减少了接受择期侵入性手术的慢性肝病患者的血小板输注需求。因此,艾曲泊帕有望在慢性乙型肝炎相关血小板减少症中获得较好的疗效,我们团队一项艾曲泊帕治疗慢性乙型肝炎相关血小板减少症的有效性及安全性的临床研究正在进行,初步观察到较好的结果。近年来,深度测序给生物学和医学研究带来了革命性的变化,转录组测序(RNA-sequencing,RNA-seq)属于第二代测序技术,可以对整个转录组进行分析,因此可以揭示整个信号网络的改变,有助于识别无法预先预测的新基因,是目前医学和生物学研究基因表达和鉴定新RNA类型的首选方法。本部分研究对慢性乙型肝炎相关血小板减少症患者艾曲泊帕治疗前后外周血单个核细胞进行转录组测序分析,以期能够发现艾曲泊帕在治疗慢性乙型肝炎相关血小板减少症过程中的关键基因变化,揭示艾曲泊帕治疗慢性乙型肝炎相关血小板减少症的重要分子生物学机制,为慢性乙型肝炎相关血小板减少症患者的升血小板及抗病毒治疗提供新思路。研究目的:描绘慢性乙型肝炎相关血小板减少症患者在艾曲泊帕治疗后外周血单个核细胞的转录组变化图谱。研究方法和结果:1.招募慢性乙型肝炎相关血小板减少症患者,须满足HBsAg和/或HBV DNA阳性至少六个月以上且血小板数低于100× 109/L,给予艾曲泊帕治疗6周,采集治疗前后外周血各10ml,提取外周血单个核细胞总RNA,进行转录组测序。经过文库构建、上机测序、数据质控和比对参考基因后获得基因表达量,选择|log2FoldChange|≥1,p-value<0.05作为差异表达过滤条件。结果筛选出表达上调基因782个,表达下调基因206个,并以聚类分析热图和火山图形式呈现。2.进一步对差异基因进行GO功能富集分析,包括细胞组分(Cellular component,CC)、分子功能(Molecular function,MF)和生物过程(Biological process,BP)三个方面。结果显示差异基因在生物过程方面主要与细菌感染的分子应答及炎症反应调节有关;在细胞组分方面主要参与细胞质膜外侧、血液微滴形成;在分子功能方面主要富集在MAPK酪氨酸/丝氨酸/苏氨酸磷酸酶活性、细胞因子活性及G蛋白偶联受体结合等相关通路。3.KEGG富集分析用于寻找显著性富集的信号通路,结果显示差异基因富集在IL-17信号通路、MAPK信号通路、类风湿性关节炎和甲型流感病毒相关通路上。4.为观察细微的基因表达变化,我们进行了基因集富集分析。由于这种分析方法可以考虑到基因表达变化的趋势,因此可以发现那些虽然表达变化微小但却具有显著功能意义的基因集。结果显示抗原结合功能、淋巴细胞介导的免疫反应、白细胞介导的免疫反应及B细胞介导的免疫反应相关基因集得到了更高的富集,且淋巴细胞介导的免疫反应与其他富集的基因集均有交集,强调了该基因集的重要性。5.提取患者艾曲泊帕治疗前后外周血单个核细胞总RNA,通过反转录方式获得cDNA,经过引物设计和实时定量PCR计算,验证了 CD69、DUSP8、RGS1、DUSP4等基因符合RNA-Seq分析的差异基因表达趋势。结论:慢性乙型肝炎相关血小板减少症患者艾曲泊帕治疗后转录组测序分析显示988个基因表达发生了显著意义的变化,其中上调基因782个,表达下调基因206个,实时定量PCR验证了 CD69、DUSP8、RGS1、DUSP4等基因与转录组分析结果一致。差异基因GO分析示基因功能与细菌感染的分子应答、炎症反应调节、细胞因子活性及G蛋白偶联受体结合等方面有关。KEGG通路富集分析进一步探索差异表达基因的通路注释显示与IL-17信号通路、MAPK信号通路、类风湿性关节炎和甲型流感病毒相关。此外,GSEA富集分析显示与体液免疫和细胞免疫相关的基因集得到了更高的富集,且淋巴细胞介导的免疫反应与其他富集的多个基因集存在交集。第二部分:艾曲泊帕通过增强CD8+CXCR5+T细胞功能发挥抗病毒作用研究背景:慢性乙型肝炎病毒感染若不能得到有效控制将会进展为肝硬化,甚至肝癌,严重威胁患者生命。促进肝细胞癌发生的因素包括病毒长期感染和高水平HBV复制等。血清中的乙肝病毒水平越高,肝脏损伤累积越多,疾病就越容易进展。因此,在慢性乙型肝炎患者中有效控制病毒载量是一个预防进展为肝细胞癌的重要手段。乙肝病毒治疗的目标是实现深度病毒学抑制,功能性治愈定义为在没有抗病毒治疗(Antiviral therapy,AVT)的情况下持续检测不到乙肝表面抗原及乙肝病毒DNA的状态,意味着即使在亚临床水平上也能完全抑制肝内的乙肝病毒复制。目前慢性乙型肝炎的抗病毒治疗手段主要是聚乙二醇-干扰素治疗及核苷酸逆转录酶抑制剂(Nucleotide reverse transcriptase inhibitors,NRTI)治疗。据统计,聚乙二醇-干扰素治疗能使10%的患者实现功能性治愈,但有可能引起骨髓抑制及诱发自身免疫性疾病。对于NRTI治疗,由于其靶向逆转录过程来抑制HBVDNA复制,并不是彻底消除病毒,因此只有少数患者在停止NRTI治疗后可以达到功能治愈,而且停止NRTI治疗可能会发生严重的红斑和肝脏失代偿。因此,通过有效的治疗手段实现慢性乙肝患者的功能性治愈是目前慢性乙肝患者的需要。在慢性乙型肝炎患者中,T细胞功能耗竭被认为是乙肝病毒长期持续感染的重要原因。通过免疫疗法充分提高HBV特异性免疫力是具有挑战性的,因为HBV特异性T细胞水平极低,T细胞反应弱,与免疫衰竭、免疫失调和免疫抑制途径有关。近期研究发现慢性乙型肝炎患者外周血中存在CD8+CXCR5+新型T细胞亚群,具有与滤泡辅助T细胞相似的表型,与B细胞共培养可增加B细胞分化为浆母细胞和浆细胞的能力,增强B细胞的抗病毒效应。临床证据也表明在慢性乙肝患者中,CD8+CXCR5+T细胞在低HBs Ag、低HBV DNA水平和HBeAg阴性的患者中比例较高,且与HBsAg、HBV DNA水平下降有显著相关性。艾曲泊帕(Eltrombopag,EP)是一种口服、小分子、非肽类TPO受体(TPO-R)激动剂。有报道称艾曲泊帕可以抑制白血病细胞系的增殖以及人成纤维细胞和成人间充质干细胞中的人巨细胞病毒(HCMV)复制。但艾曲泊帕对慢性乙型肝炎病毒是否具有抑制作用目前尚不清楚。本部分研究将探讨艾曲泊帕在慢性乙型肝炎相关血小板减少症中除促进血小板生成外,是否具有抗病毒免疫调节作用。本研究对慢性乙型肝炎相关血小板减少症患者的联合用药具有参考价值和指导意义。研究目的:探索艾曲泊帕在慢性乙型肝炎相关血小板减少症患者中的抗病毒免疫调节方式。研究方法和结果:1.基于RNA-Seq的结果及CD69的T细胞表面标记作用,我们选择了 CD69进一步探讨艾曲泊帕的免疫调节作用。我们使用流式细胞术检测T细胞表面的CD69水平,结果显示CD3+、CD4+和CD8+T细胞表面的CD69在使用艾曲泊帕处理后均明显上升。当聚焦到T细胞亚群时,无论是否进行艾曲泊帕处理,CD8+T细胞亚群表面的CD69的表达比例都明显高于CD4+T细胞亚群。因此我们认为CD69主要由CD8+T细胞亚群表达,并发挥了主要的免疫调节作用。2.我们将病人按照是否继发血小板减少分为慢性乙型肝炎相关血小板减少组和慢性乙型肝炎未继发血小板减少组,通过分别比较艾曲泊帕处理后T细胞表面CD69表达水平发现,慢性乙型肝炎相关血小板减少患者在艾曲泊帕处理后CD69表达有显著统计学意义的升高,而慢性乙型肝炎未继发血小板减少的患者组没有,证明艾曲泊帕对慢性乙型肝炎相关血小板减少患者的免疫调节作用更强。3.我们经表面标记抗体染色区分CD8+CXCR5+T细胞和CD8+CXCR5-T细胞亚群,分别统计艾曲泊帕处理后两个细胞亚群的比例变化及CD69表达水平,结果显示在艾曲泊帕处理后CD8+CXCR5+T细胞群和CD8+CXCR5-T细胞群比例均没有显著意义的改变。但是在功能方面,相比于CD8+CXCR5-T细胞,CD8+CXCR5+T细胞表面CD69的激活程度更强。4.我们使用乙肝抗原肽刺激患者外周血单个核细胞模拟病毒进入血液的应答,通过CD107a的表达来衡量活化的T细胞的脱粒程度和细胞毒活性。结果显示相比于对照组,艾曲泊帕预处理组的CD8+CXCR5+T细胞表面CD107a的表达明显增加,而CD8+CXCR5-T细胞表面CD107a的表达水平没有明显变化。5.使用乙肝抗原肽刺激患者外周血单个核细胞模拟病毒进入血液的应答过程,通过检测细胞内细胞因子表达评估活化的T细胞功能改变。结果显示CD8+CXCR5+T细胞内IFN-γ和TNF-α水平在艾曲泊帕预处理组明显增强,但CD8+CXCR5-T细胞亚群中没有观察到显著意义的变化。6.采用简单线性回归分析了细胞毒活性标志物CD107a和细胞因子IFN-γ和TNF-α的表达与CD69表达的关系。发现CD107a、IFN-γ与CD69表达正相关,TNF-α与CD69表达不相关。7.结合临床数据分析了不同临床特征下艾曲泊帕对CD8+T细胞的增强作用差异。发现艾曲泊帕的激活与患者HBV DNA含量、HBeAg状态、AST升高无关,与HBsAg数量、ALT升高有关,在HBsAg数量低、ALT正常的患者中T细胞激活更为明显。结论:本部分研究证明了 CD8+效应T细胞可能是被激活的主要细胞群,通过流式细胞术证明耗竭性T细胞中的功能表型CD8+CXCR5+T细胞亚群参与了艾曲泊帕治疗的免疫应答,在使用艾曲泊帕后,其表面CD69的表达水平明显升高,并且在乙肝抗原肽刺激下,CD8+CXCR5+T细胞中CD107a、IFN-γ和TNF-α的表达水平明显升高。这些研究表明艾曲泊帕在治疗慢性乙型肝炎相关血小板减少患者时,除发挥提升血小板水平作用外,还存在潜在的抗病毒免疫调节作用,有助于该类患者的病毒清除。同时我们的临床数据分析结果证明艾曲泊帕的应答作用与慢性乙肝病毒的感染状态无关,几乎适用于所有的慢性乙型肝炎相关血小板减少症患者。