肝脏胰岛素抵抗和代谢综合征是复杂的代谢特征,也是糖脂代谢紊乱性疾病发展的关键危险因素。目前针对selleck Enasidenib肝脏胰岛素抵抗缺乏有效的药物治疗手段。腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)通路在增强胰岛素敏感性、调节糖脂代谢稳态方面扮演着极其重要的角色。此前,本课题组已报道芒果苷衍生物X-4可通过激活AMPK信号途径改善高脂血症和肥胖。然而,X-4对肝脏胰岛素抵抗的药理作用及其对体内特定代谢物变化尚不清楚。本研究旨在通过AMPK通路研究X-4对肝脏胰岛素抵抗的调控作用,并采用肝脏代谢组学技术鉴定潜在的差异代谢物以及代谢途径的变化。一、芒果苷衍生物X-4对肝细胞胰岛素抵抗的影响研究我们首先以含有5.5 m M葡萄糖的DMEM为对照组,在含有30 m M葡萄糖和100 n M胰岛素的DMEM中,联合刺激人源Hep G2和HL-7702细胞24 h,构建高糖诱导的胰岛素抵抗细胞模型。为了验证X-4对高糖诱导的肝细胞胰岛素抵抗模型的有效性,分别从细胞葡萄糖吸收、葡萄糖转运、葡萄糖消耗、糖原生成、糖异生、氧化应激及胰岛素信号转导通路蛋白的表达等多个方面进行综合评价,并选择二甲双胍作为阳性对照药。使用葡萄糖氧化酶-过氧化物酶法检测培养基中细胞消耗的葡萄糖含量,以评估细胞对葡萄糖的摄取能力。同时,在细胞培养基中添加一种荧光标记的葡萄糖类似物2-NBDG,采用流式细胞术检测细胞吸收2-NBDG后荧光强度的变化,用于考察细胞对葡萄糖吸收的影响作用。结果显示,X-4可以剂量依赖性增加葡萄糖消耗和葡萄糖摄取。在葡萄糖代谢机制研究中,研究发现X-4可以通过增加磷酸化GSK~(Ser9)蛋白的表达来促进糖原的合成,通过抑制糖异生关键基因G6Pase和PEPCK的表达而减轻糖异生。在构建的e GFP-GLUT4稳转细胞株中,观察到X-4可以促进GLUT4的膜易位,进而增加葡萄糖的转运。采用DCFH-DA荧光探针,研究发现X-4可显著减轻氧化应激的发生。同时,结合对胰岛素信号转导通路蛋白检测结果,进一Rapamycin说明书步表明X-4可以通过激活PI3K/AKT信号通路来增强胰岛素的敏感性。此外,我们发现给予X-4处理后,显著的提高了胰岛素抵抗性肝细胞中AMPK的磷酸化蛋白水平。在基础葡萄糖培养的条件下,我们同时也观察到X-4呈现剂量依赖性的激活AMPK。结合课题组前期研究结果,表明X-4可能通过AMPK改善2型糖尿病。为了进一步研究X-4与AMPK的作用联系,我们借助X-4与疾病靶标的数据库关联网络分析,同样观察到X-4改善胰岛素抵抗与AMPK有关。同时,分子对接结果显示X-4对AMPK具有良好的对接效果。另外,我们使用AMPK抑制剂Compound C(CC)进一步证实了X-4改善肝细胞胰岛素抵抗与AMPK信号途径的激活密切相关。二、X-4通过AMPK/IRβ轴改善肝脏胰岛素抵抗的机制研究本部分我们采用高脂饮食(High fat diet,HFD)诱导C57BL/6J小鼠16周,构建小鼠胰岛素抵抗模型。在造模8周后分别给予X-4和二甲双胍继续治疗8周,考察X-4干预后对HFD诱导的糖脂代谢紊乱的影响。通过记录整个实验周期内小鼠的体重、摄食量以及一般状态的变化情况,分析X-4对DIO小鼠体重和一般状态的影响。结果显示,与HFD组相比,X-4显著改善了HFD诱导的小鼠体重增加。同时,结合空腹血糖、血清中胰岛素的含量和葡萄糖耐量等多个指标,观察到X-4可以提高小鼠胰岛素敏感性。血清生化指标检测结果表明,X-4改善了小鼠因长期摄入HFD引起的血脂代谢异常、血糖水平和肝损伤。此外,给予X-4干预后,缓解了HFD引起的小鼠肝脏脂肪沉积。X-4还显著增加了超氧化物歧化酶的水平,改善了氧化应激。肝脏生化指标检测结果表明,X-4显著降低DIO小鼠肝脏甘油三酯的水平,但对总胆固醇含量无显著性改变。基于组织病理学和形态学观察,发现X-4具有降低肝脏脂质蓄积的活性。蛋白免疫印迹结果表明,X-4可显著激活AMPK,降低脂质生成蛋白水平。免疫荧光结果提示X-4可以抑制HFD引起的肝脏组织中固醇调节元件结合蛋白-1c(Sterol regulatory element-binding protein-1c,SREBP-1c)和胰岛素受体β(Insulin receptorβ,IRβ)核易位。我们进一步采用棕榈酸(Palmitic acid,PA)诱导Hep G2细胞24 h,构建高脂诱导的体外肝细胞胰岛素抵抗模型。采用蛋白免疫印迹法检测PI3K/AKT信号通路蛋白表达情况,评估X-4对PA诱导的肝细胞胰岛素抵抗的影响。结果显示,X-4改善了PA造成的肝细胞胰岛素敏感性的降低。结合细胞油红O染色、尼罗红染色和胞内甘油三酯和总胆固醇含量改变,表明X-4具有降低脂质生成的作用。同时,我们也观察到X-4抑制了脂质生成相关蛋白的表达,而显著的提高了磷酸化AMPK的蛋白水平。此外,我们还考察了X-4对IRβ核蛋白水平的影响,研究表明X-4促进了IRβ磷酸化蛋白水平的升高,并抑制了IRβ的核易位。而免疫荧光实验进一步提示了X-4抑制IRβ核易位与激活AMPK途径有关。三、X-4改善肝脏胰岛素抵抗的肝脏代谢组学研究采用超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱联用仪(UHPLC-Q-TOF/MS)分析各组小鼠肝脏样品中代谢产物的差异与涉及的差异代谢途径。通过峰提取和归一化法得到特征离子峰表。基于MS FINDER 3.5软件对差异离子进行鉴定、比对和筛选,并使用HMDB和KEGG等数据库对差异离子进行比对分析,以确定差异代谢物的鉴定结果。采用多元变量统计分析检测肝脏中代谢物的变化。将正常组trait-mediated effects和X-4干预组相对于HFD组均表现出上下调一致的差异代谢物,导入Metabo Analyst数据库进行通路富集分析。此外,结合富集得到的差异代谢途径中所包含的差异代谢物与小鼠的代谢综合征指标进行Spearman’s相关性分析,以评价关键差异代谢物与疾病特征指数之间的关联。非靶向肝脏代谢组学结果表明,HFD诱导的DIO小鼠肝脏代谢谱发生了显著变化,而给予X-4干预后对内源性小分子代谢物有显著的改变。通路富集分析表明,X-4重点调节4种代谢途径,改变了HFD诱导的肝脏代谢组学变化,即嘌呤代谢、不饱和脂肪酸的生物合成、维生素B6代谢和色氨酸代谢。其中,我们这4条差异代谢途径包含14个我们筛选鉴定得到的关键差异代谢物。X-4可以显著逆转这些关键差异代谢物,如括腺苷、肌苷、5-羟基异尿酸等的异常水平,从而有效地改善肝脏胰岛素抵抗。Spearman’s的相关性分析结果表明,关键差异代谢物与代谢紊乱指标之间密切相关,包括体重和脂肪指数增加、血脂异常和氧化应激等。综上所述,本研究通过药理学评价和肝脏代谢组学探究了X-4对小鼠肝脏胰岛素抵抗的影响。生化、组织病理学结果表明,X-4改善肝脏胰岛素抵抗的机制与激活AMPK/IRβ轴有关。肝脏代谢组学研究结果分析,确定了14种与糖脂代谢紊乱相关的潜在生物标志物。X-4可以显著逆转HFD诱导的肝脏胰岛素抵抗小鼠中富集到的4条差异代谢途径所包含的14种关键差异代谢物的异常水平。总的来说,本研究为X-4改善肝脏胰岛素抵抗提供了理论依据,并提示未来将X-4开发用于治疗2型糖尿病等代谢综合征具有潜在的应用价值。