马铃薯Y病毒属(Potyvirus)是目前已知最大的植物RNA病毒属,该属病毒是许多粮食和经济作物(牧草、药材、果树)的重要病原,在全世界范围内造成严重经济损失。该属病毒的基因组为一条正义单链RNA,编码一个开放式阅读框(Open reading frame,ORF),在P1、Hc Pro和Pro 3个蛋白酶作用下水解为10个成熟的蛋白。其中P1蛋白位于多聚蛋白的起始处,N-端区域多变,负调节P1蛋白的自裂解,进而调节病毒的复制;C-端部分相对保守,含有一个负责P1-Hc Pro顺式裂解的丝氨酸蛋白酶结构域,负责自身从多聚蛋白中释放。研究表明,P1natural medicine蛋白酶的激活依赖于未知的寄主因子,该寄主因子调控P1蛋白从多聚肽的自裂解,是Hc Pro行使正常RNA沉默抑制子功能的关键。然而,迄今该寄主因子尚未被鉴定。本研究以芜菁花叶病毒(turnip mosaic virus,Tu MV)作为模式病毒,利用GAL4/UAS转录激活系统,以构建P1蛋白寄主因子大通量筛选体系,并对酵母双杂交文库筛选得到的一个P1互作蛋白VOZ2进行研究。取得具体研究结果如下:(1)P1蛋白寄主因子筛选体系:构建膜锚定的35S::6K2-LGX818分子式P1-Hc N10-GAL4-VP16/UAS-GFP系统,在本氏烟中通过调控P1蛋白自裂解特性观察下游基因GFP的表达发现,此系统可作为筛选P1蛋白寄主因子的有效体系。进一步,通过农杆菌介导法,构建35S::6K2-P1-Hc N10-GAL4-VP16/UAS-GFP转基因拟南芥,以获得纯合的、能观察到GFP信号的稳定遗传的转基因株系,再构建突变体库,以筛选P1蛋白寄主因子。但T_2代转基因拟南芥GFP荧光信号消失,蛋白检测表明由于6K2-P1-Hc N10-GAL4-VP16被沉默导致GFP表达下降。为进一步改进该体系,用RNA沉默途径相关(rdr6、nrpd1a、drm1/drm2)拟南芥突变体获得转基因,rdr6背景的纯合P1转基因拟南芥植株能观察到较弱GFP信号,表明RDR6在沉默6K2-P1-Hc N10-GAL4-VP16中起重要作用。这些结果表明,利用GAL4/UAS转录激活体系筛选P1蛋白寄主因子在原理上是可行的,但有待进一步优化以排除RNA沉默的影响。(2)P1和VOZ2蛋白理化特性:利用Ja Iview软件将Tu MV与其它三种马铃薯Y病毒属病毒编码的P1蛋白氨基酸序列进行比对,发现Tu MV P1蛋白N-端序列多变,C-端序列相对保守,说明N-端在调控P1与Hc Pro自裂解中起重要作用;利用Expasy和Psipred软件对VOZ2蛋白进行理化性质分析和二级结构预测发现,VOZ2是一个不稳定的亲水性蛋白,二级结构主要为无规则卷曲,说明VOZ2可能不是膜蛋白。进一步利用亚细胞定位分析表明,P1蛋白定位于细胞核和细胞质,VOZ2蛋白定位于细胞质。(3)明确Tu MV P1与VOZ2蛋白的互作:利用双分子荧光互补和酵母双杂交试验证明了Tu MV P1和VOZ2蛋白互作,但互作强度较弱。利用Tu MV-GFP侵染拟南芥voz2突变体并进行叶面积定量分析发现,较野生型拟南芥(Wild type,WT)相比,病毒积累量显著降低,但不能抵抗Tu MVRegorafenib浓度的侵染将其控制在极低的水平。说明VOZ2蛋白并不是调控P1和Hc Pro自裂解的关键寄主因子。总之,本研究构建了一个P1蛋白寄主因子筛选体系,分析了P1和VOZ2蛋白的互作及在病毒侵染中的作用,这些结果加深了对马铃薯Y病毒属病毒P1蛋白的认识,为筛选激活P1蛋白酶的寄主因子奠定了基础。