背景:乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一,高居全球女性癌症死亡原因首位,远处复发和转移是导致乳腺癌患者死亡的主要原因。化疗在乳腺癌临床治疗中发挥着不可或缺的作用,可以有效抑制乳腺癌的远处复发和转移,但是传统化疗药物在治疗中产生的毒副作用严重影响着患者的生活质量及治疗效果,不利于长期预后。中药提取物莪术醇(Curcumol,CUR)具有抑制乳腺癌细胞转移的作用,并且具有良好的安全性,然而水溶性差限制了其临床应用。目的:制备一种温度/还原双重响应型纳米凝胶,实现莪术醇的靶向递送,提高抗肿瘤和抑制转移的效果,旨在为乳腺癌易复发和转移的治疗提供新思路,为莪术醇用于乳腺癌的临床治疗提供理论支撑。方法:(1)H-SS-P纳米凝胶的制备及表征。首先采用两步酰胺反应合成HA-SS-PNIPAAm共聚物,采用核磁共振氢谱(Nuclear Magnetic Resonance,~1H-NMR)对其结构进行验证。随后采用直接加热法制备H-SS-P空白纳米凝胶,并观察溶液外观。分别采用紫外可见分光光度法和芘荧光探针法测定共聚物的低临界溶解温度(lower critical solution temperature,LCST)和临界胶束浓度(Critical micelle concentration,CMC)。(2)H-SS-P@CUR的制备及表征。采用透析法制备H-Staurosporine生产商SS-P@CUR载药纳米凝胶。分别采用高效液相Z-IETD-FMK体内实验剂量色谱仪(High Performance Liquid Chromatograph,HPLC)、动态光散射(Dynamic Light Scattering,DLS)和透射电子显微镜(Transmission Electron Microscope,TEM)测定纳米凝胶的载药量和包封率、H-SS-P@CUR的粒径分布、zeta电位及粒子形态。采用透析法评价H-SS-P@CUR的体外释药行为。(3)H-SS-P@CUR的体外抗肿瘤活性评价。以4T1小鼠乳腺癌细胞和L929小鼠成纤维细胞为细胞模型,分别采用MTT细胞毒性实验、细胞摄取实验、细胞划痕愈合、Transwell迁移和侵袭实验考察H-SS-P@CUR体外抑制肿瘤细胞生长和转移效果。(4)H-SS-P@CUR的体内抗肿瘤活性评价。建立4T1乳腺癌荷瘤小鼠模型,分别考察纳米凝胶在小鼠体内的生物分布和肿瘤靶向性、抗肿瘤效果和安全性以及对小鼠乳腺癌肺转移的抑制作用。结果:(1)通过两步酰胺化反应成功合成了HA-SS-PNIPAAm共聚物,通过~1H-NMR验证了其化学结构。H-SS-P共聚物溶液加热至LCST以上时,溶液从无色透明变为淡蓝色乳光,表明纳米凝胶自组装形成。该纳米凝胶的CMC值较低,有利于其在体内循环过程中稳定存在。(2)通过透析法成功制备了H-SS-P@CUR载药纳米凝胶,包封率达到80%左右,载药量最高可达24.45%。TEM和DLS结果显示,H-SS-P@CUR的粒度均匀,外观呈球形,zeta电位约为-20m V,具有良好的稳定性。体外药物释放研究表明,H-SS-P@CUR在高浓度GSH的条件下,24 h内CUR累积释放量显著高于低浓度GSH下的释放量,验证了H-SS-P@CUR的还原敏感释药特性。(3)通过体外细胞学实验对H-SS-P@CUR的抗肿瘤活性进行评价。MTT细胞毒性实验结果显示,空白纳米凝胶具有较好的安全性和生物相容性,H-SS-P@CUR在4T1细胞中的毒性高于游离CUR,而对L929细胞的毒性始终弱于游离CUR。细胞摄取实验结果显示,4T1细胞对载药纳米凝胶具有更强的摄取能力,但是经游离HA阻断后,其摄取效果显著降低,验证了纳米凝胶是依赖于HA与肿瘤细胞表面过表达的CD44受体介导的细胞内吞进入细胞发挥抗肿瘤作用。细胞划痕愈合、Transwell迁移和侵袭实验结果表明,H-SS-P@CUR抑制4T1细胞迁移和侵袭的效果强于游离CUR。(4)通过体内动物学实验对H-SS-P@CUR的抗肿瘤活性进行评价。小动物活体成像结果表明,载药纳米凝胶组在小鼠肿瘤部位的荧光Amycolatopsis mediterranei强度明显高于游离组和HA预处理组,在动物水平上验证了纳米凝胶的主动靶向性。体内安全性和药效学结果显示,游离CUR和H-SS-P@CUR的体内安全性良好,H-SS-P@CUR治疗组的小鼠肿瘤体积最小,且肺转移结节数最少,表明H-SS-P@CUR具有良好的抑制肿瘤生长和肺转移的作用。结论:本课题以HA为骨架,胱胺二盐酸盐为交联剂,接枝共聚PNIPAAm制备了温敏共聚物。以CUR为模型药物,利用PNIPAAm的温敏性及与CUR的疏水相互作用,成功制备了温度/还原双重响应型载药纳米凝胶H-SS-P@CUR。H-SS-P@CUR具有较强的载药能力,并展现出GSH触发的药物释放行为。游离CUR和H-SS-P@CUR在体外、体内均表现出较好的抗肿瘤效果和抑制转移作用。此外,纳米凝胶可以依赖于高通透性和滞留效应(Enhanced Permeability and Retention Effect,EPR)的被动靶向和CD44受体介导的主动靶向作用,实现药物在肿瘤部位的富集,提高抗肿瘤疗效。因此,CUR被包载到纳米凝胶中后,具有更显著的抗肿瘤活性和抗肿瘤转移优势,可以进一步提高乳腺癌的临床治疗效果。