菊糖是一种常见的植物多糖,由果糖基通过β-(2,1)糖苷键连接而成。为了实现菊糖的高值利用,可采用生物酶法转化菊糖为功能型寡糖(如双果糖酐,Difructose anhydride,DFA)或其他具有高附加值的产品。随着人们对低热量甜味剂的需求不断提升,DFA作为功能型的低热量新型天然甜味剂受到了广泛的关注。其中,一型双果糖酐(DFA I)和三型双果糖酐(DFA Ⅲ)可以分别由同属于糖苷水解酶91家族(GH91)的一型菊糖裂解酶(DFA I-forming Inulin Lyase,ILase I,E.C.4.2.2.17)和三型菊糖裂解酶(DFA Ⅲ-forming Inulin Lyase,ILase Ⅲ,E.C.4.2.2.18)水解菊糖获得。目前,ILase Ⅲ的结构信息和催化机理已经被解析,ILase I的催化机理也有所研究,然而这两种具有相似催化功能的裂解酶的产物特异性尚未被阐明。此外,大多数关于多糖水解酶的催化机理的研究,主要关注发生在催化口袋的反应,对底物结合及产物释放的催化过程鲜有报道。因此,本课题选择了新微生物来源的ILase I;接着通过理性设计的方式,提高ILase I的热稳定性;随后解析ILase I的晶体结构,基于ILase I的X-射线晶体学信息,采用表面修饰的策略提高ILase I的催化活力;最后解析ILase I和小分子菊糖型寡糖的复合物晶体结构,初步探讨ILase Ⅰ和ILaseⅢ的产物特异性;同时结合分子动力学模拟,提出ILase Ⅰ的底物结合路径和产物释放通道。具体研究内容和结论如下:(1)鉴定新型ILase Ⅰ(SpILase)。在NCBI数据库中筛选来源于Streptomyces peucetius subsp.caesius ATCC 27952的一段被注释为ILase的基因。合成编码Sp ILase的基因并导入载体中,构建重组质粒p ET-22b(+)-Sp ILase,随后转化至E.coli BL21(DE3)中诱导表达,并采用亲和层析的方法分离纯化Sp ILase。鉴定Sp ILase催化菊糖所生成的双果糖酐为DFA I。Sp ILase的最适p H和反应温度分别为6.5和45℃,其T_m值为75.49℃。此外,Ba~(2+)可以轻微提高Sp ILase的催化活力。以菊糖为底物,Sp ILase的K_m值和k_(cat)NSC 125973生产商/K_m值分别为3.08 m M和199.09 m M~(-1) s~(-1),表明Sp ILase与菊糖有较强的亲和力。以10 g/L的菊糖为底物,在p H 6.5和45℃条件下,6 h后DFA I的产率为82.97%。(2)理性设计提高SpILase的热稳定性。基于氨基酸序列和模拟结构,筛选获得15个突变位点。随后筛选出4个热稳定性显著提高的突变体Q69L、E201I、Q234L和K310G。叠加优势突变位点,获得两个三点突变体Q69L/Q234L/K310G和E201I/Q234L/K310G,与野生型相比,其T_m值分别提高了4.99℃和4.50℃,70℃下的近似半衰期均高约45倍,最适温度分别为50℃和45℃,相对酶活分别为100.03%和53.32%。在最适条件下,分别使用www.selleck.cn/products/r428两个三点突变体水解菊糖,6 h后DFA I的产率均约为84%。分子动力学模拟表明,两个三点突变体增加了局部的疏水相互作用、改变了表面局部的静电势、稳定了部分二级结构,从而提升了Sp ILase的热稳定性。(3)解析SpILase的晶体结构,基于催化效率的分子改造。采用经典的气相扩散法获得Sp ILase的蛋白单晶,通过X-射线衍射解析了分辨率为1.69(?)的蛋白晶体结构(PDB登录号:8HSN)。随后分析发现Sp ILase是典型的右手平行的β-螺旋蛋白,在结晶条件下采用三聚体的组装模式。Sp ILase的三聚体和单亚基均呈现出“下松上紧”的三棱柱形态。此外,其单亚基主要由β-strand和loop结构组成,其特征性结构主要有“天冬酰胺梯子”和脂肪族氨基酸残基堆积。基于解析的晶体结构,采用表面修饰的策略提高Sp ILase的催化活力。最终,获得三点突变体A282S/A254S/Q69I,其催化效率和底物亲和力都显著提高,其酶活为636genetic evolution.28 U/mg是Sp ILase酶活的1.46倍。分子动力学模拟表明,突变体A282S/A254S/Q69I同蔗果五糖(GF4)之间具有较低的结合自由能,从而解释了其催化活力的提高。(4)解析SpILase的复合物结构、底物结合路径和产物释放通道。通过浸泡获得Sp ILase的复合物晶体,并通过X-射线衍射解析其晶体学信息。复合物结构的分辨率为1.44(?)(PDB登录号:8HUI),并观察到该结构中有四分子蔗果五糖、两分子DFA I和一分子果糖,Sp ILase与配体之间形成了大量氢键相互作用和疏水相互作用。综合分析,发现GH91家族的晶体结构的整体形状相似,其氨基酸序列也具有较高的保守性。通过结构比对,发现ILase I和ILase Ⅲ的催化中心分别具有三段特征loop,分别构成了其催化口袋独特的拓扑结构。通过替代突变,发现所获7个突变体的酶活力大幅下降或丢失,表明这三段特征loop对Sp ILase的催化反应具有重要作用。通过分子动力学模拟,推测ILase I和ILase Ⅲ可能采用不同的通道将产物释放到溶液体系中。基于配体的结合位点和预测的通道,筛选了20个关键位点并分为4个残基群,构建这些位点的丙氨酸突变体。18个突变体的催化活力都具有不同程度的损失,而远离催化口袋的T247、S267、R296和D298的突变体酶活力降低约90%,验证了所筛选的关键位点在Sp ILase催化过程中也具有重要作用。最终,通过综合分析复合物结构和丙氨酸突变体结果,发现了菊糖底物与SpILase潜在的结合路径,并提出了双果糖酐产物在SpILase中的潜在释放通道。