单核细胞增生李斯特菌(Listeriamonocytogenes,Lm)是一种致死率较高的食源性病原菌,依赖于多种表面蛋白促进对宿主感染。Lm表面蛋白主要分为共价结合蛋白,非共价结合蛋白和膜锚定蛋白,它们通过特定的相互作用附着在细胞壁上。壁磷壁酸(Wall teichoic acids,WTAs)是细胞壁表面最丰富的糖聚合物,参与细菌表面蛋白的锚定,进而调节细菌形态、自溶和毒力。WTAs结构是细菌菌体抗原的基础。在李斯特菌中,WTAs分为两种类型,分别是以鼠李糖或N-乙酰葡萄糖胺修饰的Ⅰ型WTAs(血清型1/2、3和7)和以葡萄糖/半乳糖进一步修饰N-乙酰葡萄糖胺的Ⅱ型WTAs(血清型4、5和6)。目前已经揭示鼠李糖修饰的Ⅰ型WTAs通过GW(glycine-tryptophan)结构域促进InlB和Ami在细胞表面的有效保留,介导细菌的自溶活性和毒力。此外,半乳糖基化的Ⅱ型WTAs对毒力蛋白InlB的表面锚定同样至关重要。GW结构域广泛存在于革兰阳性细菌中参与表面蛋白的锚定,但其与糖基化修饰WTAs之间的具体结合机制有待深入研究。前期从暴发李斯特菌病病例的羊脑中分离获得Lm XYSN菌株,经基因组学比较分析,发现其与谱系Ⅱ的血清型1/2a菌株具有较近的遗传地位。为了揭示Lm XYSN高毒力的分子致病机制,构建了转座突变库,以人结肠癌上皮细胞为体外模型,对毒力相关基因进行了高通量筛选。LMxysn_1095::Tn对Caco-2BBe细胞系的侵袭力显著下降,对小鼠的毒力相比野生株降低了 105倍。进一步分析提示LMxysn_1095基因(galT)所在的基因簇有可能参与WTAs糖基化修饰,而该基因在细菌毒力中的分子作用机制还有待阐明。本研究以Lm XYSN为生物材料,研究了其菌体和鞭毛抗原以及毒力表型;解析了 Lm XYSN菌株的WTAs结构及galT在WTAs糖基化修饰过程和毒力中的作用;探究了独特的WTAs结构与毒力蛋白锚定的锚定机制并初步明确了 LygA蛋白的生物学功能;通过小鼠模型评价了ΔgalT缺失株作为减毒活疫苗的保护性免疫应答。本研究有助于揭示血清型4h菌株独特的WTAs结构在李斯特菌致病中的作用机制,同时为李斯特菌病的预防和治疗提供理论基础。1.新现血清型4h单核细胞增生李斯特菌的毒力评价玻板凝集试验结果显示Lm XYSN的菌体抗原是4型,鞭毛抗原与H-A和H-B凝集,不与H-C反应。因其不同于现有13种血清型的组合,该类菌株的血清型被命名为新的血清型4h。利用结肠癌上皮细胞系Caco-2BBe测定了血清型4h菌株(Lm XYSN、Lm 16E和Lm 15LG)与强毒参考菌株的细胞侵袭能力。结果显示血清型4h菌株的细胞侵袭能力均显著高于其它所有Lm菌株。同时,以相同剂量感染C57BL/6小鼠,血清型4h菌株在多个脏器中的定殖能力均显著高于其它参考菌株,并在3-5天内引起小鼠死亡。以1×109 CFU灌胃感染豚鼠结果显示,Lm XYSN感染组豚鼠全部死亡,而Lm EGD-e感染组均存活。这些结果表明血清型4h菌株具有较高的毒力。对易感宿主湖羊灌胃感染Lm XYSN和Lm EGD-e,监测6d内湖羊的体温体重变化。结果显示Lm XYSN感染组湖羊与空白组的相比体温上升,体重下降,而Lm EGD-e感染组相对稳定。同时,Lm XYSN在肝脏和肠道中的定殖能力比Lm EGD-e高158-426倍。Lm XYSN先后突破肠道屏障和血脑屏障引起胃肠炎和脑膜炎等典型的羊李斯特菌病,导致湖羊在感染21-39天内全部死亡。在感染早E7080 molecular weight期,Lm XYSN抑制湖羊脾脏、肝脏和肠系膜淋巴结中IFN-γ、TNF-α和IL-6的表达。此外,通过ELISA测定感染不同时间点外周血中IFN-γ的含量,结果显示相较于Lm EGD-e感染组,在感染第1 d和第2 d,Lm XYSN显著抑制了湖羊体内IFN-γ的分泌。这些结果表明血清型4h菌株在感染早期显著抑制体内促炎因子的表达,从而促进细菌在体内的生存与致病。2.半乳糖基转移酶基因galT增强李斯特菌毒力的作用机制LMxysn_1095基因(galT)被预测为功能未知的糖基转移酶,其所在的基因簇有可能参与WTAs糖基化修饰。为此,通过电喷雾质谱解析了野生株和ΔgalT缺失株的WTAs结构,结果显示Lm XYSN的WTAs上仅有半乳糖基修饰,属于Ⅱ型WTAs(Gal-WTAs)。而galT基因的缺失导致WTAs上的半乳糖基缺陷,提示该基因编码半乳糖基转移酶(Galactosyltransferase,GalT),参与WTAs上的半乳糖基修饰。玻板凝集试验显示ΔgalT缺失株不能与菌体抗原的Ⅳ型Lm鉴定血清凝集,表明半乳糖基化WTAs是细菌菌体抗原的基础。透射电镜结果显示,ΔgalT缺失株的细胞壁结构改变。在对抗菌肽LL-37和CRAMP的耐受试验中,ΔgalT缺失株的生存能力显著降低。这些结果表明半乳糖基化WTAs通过维持细胞壁结构的完整性增加细菌对抗菌肽的抵抗力。提取细菌的细胞壁蛋白和分泌蛋白,通过WB分析毒力蛋白在细胞表面的定位。结果显示InlB、Ami和ActA蛋白从ΔgalT缺失株细胞表面脱落。同时,利用ActA抗体标记感染细胞的细菌,结果显示ΔgalT缺失株不能聚集宿主肌动蛋白,限制了其在细胞间的扩散,而野生株和回复株的细菌末端均能形成明显的哈雷彗星样尾巴。这些结果表明半乳糖基化WTAs通过促进毒力蛋白InlB、Ami和ActA的有效锚定,介导细菌毒力。以Caco-2BBe为细胞感染模型的试验结果显示,galT基因的缺失不影响细菌的黏附能力,但显著降低了细菌的侵袭和胞内增殖能力。细菌在小鼠脏器中的定殖能力测定结果显示,ΔgalT缺失株仅低剂量定殖于部分回肠中(72.44 CFU/g),而野生株和回复株在脏器中的细菌载量均处于较高水平(103-105 CFU/g)。此外,LD50测定结果显示ΔgalT缺失株的LD50相比于Lm XYSN增加了 105倍。这些结果充分表明galT基因是重要的毒力相关因子,促进细菌突破肠道屏障并定殖于肝脏和脾脏中。3.半乳糖基化壁磷壁酸与自溶素LygA互作介导细菌稳态和毒力提取Lm XYSN和ΔgalT菌株的细胞壁蛋白,利用定量蛋白组学分析进一步挖掘受半乳糖基化WTAs调控的表面蛋白,结果显示除InlB和Ami外,ΔgalT缺失株细胞表面一种新的GW结构域蛋白LMxysn_1092(LygA)蛋白含量降低了 24.42倍。qRT-PCR试验显示野生株和ΔgalT缺失株中lygA的转录水平相似,且WB结果证明大量LygA从ΔgalT缺失株细胞表面脱落。这些结果表明半乳糖基化WTAs对于LygA在细胞表面的有效锚定至关重要。为了探究LygA与WTAs之间的相互作用,将纯化的LygA蛋白偶联在CM5芯片表面,分别用Lm XYSN、ΔgalT和ΔgdlT::galT菌株的WTAs作为分析物,通过表面等离子共振技术(SPR)测定两者之间的结合能力,结果显示LygA与Gal-WTAs的亲和力(KD=1.54μM)显著高于其与半乳糖基化缺陷型WTAs的亲和力(KD=7.61μM)。同时,LygAGW蛋白与WTAs的SPR试验结果显示,其与Gal-WTAs的相互作用显示出与LygA相同的趋势,且在WTAs浓度相同的条件下,LygAGW与WTAs的结合能力更强。此外,通过WB分析GW基序数量对于LygA锚定的影响,结果显示随着GW结构域数量的持续减少,LygA逐渐从细胞壁表面脱落,尤其是当4个GW结构域被敲除时,LygA几乎失去了锚定能力。总之,这些结果表明LygA在细胞表面的完整保留通过C末端固定数量的GW基序与WTAs以Gal依赖的方式结合。此外,不受WTAs鼠李糖基化影响的Auto蛋白与Gal-WTAs具有较强的相互作用(KD=0.08 μM)。经氨基酸比对分析发现,Auto蛋白中的GW结构域与LyPF-03084014价格gA蛋白中的GW结构域同源性相对较低。这些结果表明WTAs与GW蛋白的结合能力取决于GW基序特定的氨基酸序列和WTAs糖基化模式的多样性。为了进一步探究LygA蛋白的功能,通过SMART软件分析显示LygA是由LYZ2和GW结构域组成的自溶素。利用溶壁微球菌测试了 LygA蛋白的水解酶活性,结果显示LygA的酶活为211 U,其可能改变了溶壁微球菌表面的疏水性,致使细胞大量聚集。受WTAs糖基化调控表面结合的自溶素Ami促进细菌的自溶。为了测试LygA在细菌自溶中的作用,成功构建了 ΔlygA、Δami和ΔlygA/ami缺失株。自溶活性测定结果显示在34h之内,ΔlygA缺失株的自溶生理水平略高于ΔlygA/ami双缺失株,但显著低于Δami缺失株。此外,蛋白组学分析显示LygA在细胞表面的含量显著高于Ami在细胞表面的含量。这些结果表明半乳糖基化WTAs借助于细胞壁表面的自溶素LygA和Ami促进细菌的自溶,其中LygA占主导作用。为检测LygA在细菌毒力中的作用,以Caco-2和HepG-2细胞评估了其对上皮细胞的黏附和侵袭能力,结果显示野生株和回复株相比于ΔlygA缺失株具有更高的黏附和侵袭能力。在小鼠灌胃感染模型中,LygA的缺失显著降低了细菌在肝脏、结肠和大脑中的定殖能力。这些结果表明LygA是Lm毒力所必需的,参与细菌在肠道的早期定殖和对宿主的进一步感染。4.ΔgalT减毒活疫苗候选株的保护性应答研究以C57BL/6小鼠为模型,皮下接种Lm XYSN和ΔgalT缺失株,评价候选疫苗的安全性,结果显示ΔgalT缺失株在肝脏和脾脏中的细菌载量均显著低于Lm XYSN感染组,并能在短时间内被机体快速清除。此外,免疫后小鼠各脏器的组织病理学分析显示,ΔgalT缺失株免疫组与PBS免疫组一样,各脏器均无病理学变化。这些结果表明ΔgalT缺失株作为减毒活疫苗具有较高的安全性。利用ELISA检测疫苗候选株免疫后小鼠体内抗体的变化规律,结果显示ΔgalT缺失株在免疫14 d后,诱导了抗Lm XYSN抗体,且抗体滴度逐渐增加,在免疫后21 d达到峰值。同时,在免疫后21 d对小鼠脾脏中细胞因子的转录水平进行测定,结果显示ΔgalT缺失株诱导Th1倾向的细胞因子IFN-y、TNF-α、IL-6和IL-17的高水平表达。重要的是,以致死剂量的Lm XYSN对免疫28 d后小鼠进行攻毒,结果显示ΔgalT缺失株能为小鼠提供100%免疫保护,且在免疫后105 d仍可提供83.3%的保护效率。这些结果表明ΔgalT缺失株可作为减毒活疫苗候选株,刺激机体产生强烈的体液免疫和细胞免疫应答,从而介导高水平免疫保护。综上所述,Lm XYSN为新现强毒株,对多种动物具有高致病力,基于其特有的菌体抗原和鞭毛抗原特征被新命名为血清型4h菌株。Lm XYSN的WTAs上仅有半乳糖基修饰,为Ⅱ型WTAs。galT基因参与WTAs上的半乳糖基修饰,并介导重要毒力蛋白InlB、Ami和ActA的表面锚定。同时,新发现的LygA自溶素通过一定数量的GW结构域与Gal-WTAs直接相互作用,调节细菌稳态和毒力。此外,ΔgalT缺失株作为减毒活疫苗候选株可高效保护同源型菌株的攻击。本研究揭示了独特的Ⅱ型WTAs在血清型4h菌株毒力增强中的作用机制,其可作为潜在的药物靶标,history of oncology对李斯特菌病的预防和控制具有重要意义。