随着人们生活方式的改变及人口老selleck INCB28060龄化,脑血管疾病(cerebrovascular disease;CVD)成为全球重点防治的三大疾病之一,其中患缺血性脑卒中(cerebral ischemic stroke;CIS)的病人数在所有CVD患者的占比一直居高不下,尽管临床上有许多药物应用于CVD的预防、发现与诊疗阶段,且急性发病期的血管再通以及再通后的脑缺血再灌注损伤(cerebral ischemia/reperfusion injury;CIRI)相关的治疗方面均有所成就,但如何更好地发现疗效好且经济实惠的药物方面的问题也亟待解决。祖国中医药已有近五千年的发展史,对于CVD的治疗具有丰富的临床经验,且中药复方兼具疗效好与经济实惠的优点,可广泛应用于临床;但中药复方具体的治疗机制并不完全明确,如何通过现代化的技术手段研究和阐释中药复方的治疗机制成为了目前研究的重点。补阳还五汤是中医治疗气虚血瘀型卒中的传统方剂,由黄芪、当归、赤芍、地龙、川芎、桃仁、红花组成,其益气、活血、通络的功效,对治疗气虚血瘀型卒中疗效甚佳。本实验室前期研究也证实补阳DENTAL BIOLOGY还五汤可以通过细胞凋亡、自噬等多重途径治疗脑卒中以及减轻卒中后的再灌注损伤。铁死亡(ferroptosis)是2012年提出的新型细胞死亡方式,众多研究表明铁死亡与CIRI的发生发展密切相关,且有研究表明黄芪、当归、红花等单味药的主要成分可以通过抑制铁死亡对CIRI起到一定的治疗作用。但是补阳还五汤是否可以通过铁死亡途径抗CIRI目前尚不清楚。课题以SD大鼠与HT22细胞为研究对象,从在体和离体两个方面探究补阳还五汤是否可以基于铁死亡途径抗CIRI。本研究共分为三个部分:1.脑血流量降低对大鼠大脑中动脉栓塞/再灌注(MCAO/R)模型的效果研究;2.补阳还五汤通过调控大鼠脑铁代谢抗脑缺血再灌注损伤的研究;3.补阳还五汤通过调控铁离子代谢减轻OGD/R模型HT22细胞损伤的研究。第一部分脑血流量降低对大鼠大脑中动脉栓塞/再灌注模型的效果研究目的:探讨脑血流量的变化值对制备大鼠MCAO/R模型的效果。方法:取体重为250 g～280 g健康雄性SD大鼠25只,随机分为5组:A组(脑血流量下降10%～20%)、B组(脑血流量下降21%～30%)、C组(脑血流量下降31%～40%)、D组(脑血流量下降41%～50%)、E组(脑血流量下降51%～60%)。所有动物均采用改良线栓法制备MCAO/R模型,且均在激光散斑血流灌注成像仪监测下进行模型制备。所有入组大鼠均于再灌注24 h进行神经功能评分观察模型成功率。再灌注72 h后计算大鼠梗死后死亡率、观察并纪录体重变化情况、TTC染色检测脑梗死体积。结果:梗死后死亡率:E组为40%(2只),A、B、C、D组均为0。A组大鼠神经功能评分正常、无脑组织梗死,因此以A组大鼠作为基本对照组。神经功能评分:与A组相比,B组大鼠神经功能评分无显著性差异(P>0.05),C、D、E各组大鼠神经功能评分明显升高(P<0.01);其中C、D组之间无显著性差异(P>0.05),E组高于D组(P<0.05)。体重变化情况:A、B组无明显差异(P>0.05),C、D、E三组较A组体重下降明显(P<0.01),变化幅度顺序为E>D>C>B;且每组均较前一组比较体重下降明显(P<0.05)。脑梗死体积:与A组相比,B、C、D、E组大鼠脑梗死灶明显(P<0.01),梗死体积顺序为E>D>C>B;且每组均较前一组比较脑梗死体积更为显著(P<0.05)。小结:大鼠MCAO/R模型制备过程中缺血侧脑血流量下降百分比在41%～50%之间模型效果最佳,MCAO/R模型成功率高、重复性及稳定性好。第二部分补阳还五汤通过调控大鼠脑铁代谢抗脑缺血再灌注损伤的研究目的:探究补阳还五汤调控铁代谢抑制铁死亡抗CIRI的机制研究方法:将60只清洁级雄性SD大鼠采用随机分组的方式分为4组:假手术组(Sham组)、模型组(MCAO/R组)、补阳还五汤组(BYHWD组)、阳性对照组(甲磺酸去铁胺,DFO组),每组各15只。除Sham组外,其余三组均建立MCAO/R模型缺血2 h再灌注72 h。其中对BYHWD组和DFO组大鼠分别给与补阳还五汤和甲磺酸去铁胺干预处理,其余两组予以等量生理盐水。所有大鼠均在再灌注72 h后,采用Zea longa神经功能学评分以及黏胶揭除实验评估神经功能缺损情况和躯体感觉损伤情况;采用TTC染色检测脑组织梗死体积;采用HE染色及尼氏染色观察组织形态及神经元;采用普鲁士蓝染色观察铁沉积情况;采用透射电镜观察神经元及线粒体结构;采用酶联免疫吸附实验(Elisa法)检测MDA、GSH以及组织铁含量。采用Western Blot法检测Tf R1、DMT1、FPN1、GPX4蛋白表达水平;免疫荧光染色法检测蛋白GPX4的表达水平。结果:Sham组大鼠没有明显的神经功能缺损、躯体感觉损伤和脑组织梗死现象;组织染色显示脑组织结构紧密,神经元形态正常,数量丰富,多见尼氏小体,未见明显脑铁沉积。透射电镜显示神经元线粒体结构正常,线粒体嵴及外膜完整。酶联免疫吸附实验结果显示Sham组大鼠组织铁含量及血清MDA水平较低,GSH水平较高;蛋白印迹实验及免疫荧光实验结果显示Sham组大鼠脑组织内的FPN1、GPX4蛋白表达丰富,Tf R1、DMT1的表达较低。与Sham组大鼠相比,MCAO/R组大鼠神经功能缺损与躯体感觉损伤明显,神经功能学评分增高;脑组织梗死体积明显增加;组织染色显示脑组织结构疏松,神经元排列紊乱,数量明显减少,神经元水肿明显,空泡样、核固缩等病理现象多见,尼氏小体明显减少,脑铁沉积量明显增多;透射电镜显示线粒体明显肿胀,基质溶解,嵴减少,部分严重者外膜破裂、崩解。酶联免疫吸附实验结果显示:MCAO/R组大鼠组织铁含量及血清MDA水平明显升高(P<0.01),GSH水平明显降低(P<0.01);蛋白印迹实验及免疫荧光实验结果显示:MCAO/R组大鼠脑组织内的FPN1、GPX4蛋白表达显著减少(P<0.05),蛋白Tf R1、DMT1的表达量明显增高(P<0.05)。与MCAO/R组大鼠相比,BYHWD组和DFO组大鼠神经功能缺损与躯体感觉损伤明显减轻,神经功能学评分减少;脑组织梗死体积明显降低;组织染色显示脑组织结构相对紧密,神经元数量明显增多,神经元水肿明显减轻,空泡样、核固缩等病理现象显著减少,尼氏小体明显减少,脑铁沉积量明显增多;透射电镜显示神经元中线粒体部分轻度肿胀,线粒体嵴较多,外膜完整,损伤明显减轻。酶联免疫吸附实验结果显示:BYHWD组和和DFO组大鼠组织铁含量及血清MDA水平明显降低(P<0.01),GSH水平明显升高(P<0.01);蛋白印迹实验及免疫荧光实验结果显示:BYHWD组和DFO组大鼠脑组织内的蛋白FPN1、GPX4表达增多(P<0.05),蛋白Tf R1、DMT1的表达量降低(P<0.05)。与DFO组大鼠相比,BYHWD组大鼠神经功能缺损、躯体感觉损伤、脑组织梗死体积、组织染色以及电镜均无明显差异(P>0.05)。酶联免疫吸附实验结果显示:BYHWD组大鼠组织铁含量和GSH水平无明显差异(P>0.05),MDA水平明显减少(P<0.05);蛋白印迹实验及免疫荧光实验结果显示:BYHWD组大鼠脑组织FPN1、Tf R1、DMT1蛋白表达无明显差异(P>0.05),GPX4蛋白表达明显增高(P<0.05)。小结:补阳还五汤可以通过降低脑组织中蛋白Tf R1、DMT1的表达,增强FPN1、GPX4的表达,降低大鼠缺血再灌注侧半暗带区脑组织中的铁离子含量,抑制了因过量铁参与芬顿反应产生的活性氧及随后的有毒脂质过氧化物蓄积引起的铁死亡,减轻CIRI,促进脑组织神经功能的恢复。第三部分补阳还五汤通过调控铁离子代谢减轻氧糖剥夺/复氧复糖HT22细胞损伤的研究目的:探究补阳还五汤通过调控铁离子代谢抑制铁死亡减轻OGD/R模型HT22细胞损伤的作用机制。方法:通过建立OGD/R模型,将HT22细胞随机分为:正常组(Control)、模型组(OGD/R)、模型+补阳还五汤含药血清组)(1%BYS、3%BYS、5%BYS、7%BYS、10%BYS)、模型+空白血清组(1%CS、3%CS、5%CS、7%CS、10%CS),通过CCK-8法和检测LDH(乳酸脱氢酶)漏出率探讨补阳还五汤含药血清对HT22细胞OGD/R损伤模型保护作用的最适浓度;再将HT22细胞分为对照组(Control)、模型组(OGD/R)、模型+补阳还五汤含药血清组(OGD/R+BYHWDS)以及模型+阳性对照组(OGD/R+DFO),通过Elisa法检测各组细胞MDA、GSH的含量;通过流式检测各组细胞ROS的含量;通过荧光探针法检测各组细胞内Fe~(2+)含量;通过Western Blot法检测各组细胞铁稳态相关蛋白Tf R1、FPN1、DMT1、GPX4的表达水平;通过免疫荧光染色法检测各组细胞蛋白Tf R1、FPN1、DMT1、GPX4的表达水平。结果:CCK-8法、LDH漏出率检测结果说明低浓度补阳还五汤含药血清均能不同程度增强缺氧缺糖/复氧复糖HT22细胞活力,降低LDH漏出率,对神经元起到保护作用。其中以3%补阳还五汤含药血清治疗效果最佳,故本实验选择浓度为3%的补阳还五汤含药血清用于后续实验研究。Control组神经元的GSH含量较高,ROS、MDA、Fe~(2+)含量较低;蛋白印记实验显示:Tf R1、DMT1蛋白表达较少,FPN1、GPX4蛋白表达丰富;免疫荧光实验显示:Tf R1、DMT1蛋白的平均荧光强度弱,蛋白FPN1、GPX4表达的平均荧光强度强。与Control组相比,OGD/R组神经元的GSH含量明显降低(P<0.01),ROS、MDA、Fe~(2+)含量均明显升高(P<0.01);蛋白印记实验显示:蛋白Tf R1、DMT1表达水平显著升高(P<0.05),蛋白FPN1、GPX4表达水平显著降低(P<0.05);免疫荧光实验显示:Tf R1、DMT1蛋白的平均荧光强度显著升高(P<0.05),FPN1、GPX4蛋白的平均荧光强度显著降低(P<0.05)。与OGD/R组相比,BYHWDS组和DFO组神经元细胞中的GSH含量明显升高,ROS、MDA、Fe~(2+)含量均明显降低(P<0.01);蛋白印记实验显示:蛋白Tf R1、DMT1表达水平显LXH254著降低(P<0.05),蛋白FPN1、GPX4表达水平显著升高(P<0.05);免疫荧光实验显示:Tf R1、DMT1蛋白表达的平均荧光强度明显变弱(P<0.05),FPN1、GPX4蛋白表达的平均荧光强度明显变强(P<0.05)。与DFO组相比,BYHWDS组神经元细胞中的Fe~(2+)含量明显下降(P<0.01),MDA含量减少(P<0.05),GSH、ROS含量无明显差异(P>0.05);蛋白印记实验显示:Tf R1、DMT1、FPN1、GPX4蛋白表达水平均无明显差异(P>0.05);免疫荧光实验显示:Tf R1、DMT1、FPN1、GPX4蛋白的平均荧光强度均无明显差异(P>0.05)。小结:补阳还五汤可通过降低缺氧缺糖/复氧复糖HT22细胞中蛋白Tf R1、DMT1表达水平,增强FPN1、GPX4的表达,降低细胞中的Fe~(2+)含量,减少细胞中ROS、MDA的产生,从而抑制铁死亡,减轻OGD/R 22细胞损伤,促进神经功能恢复。结论:1.大鼠MCAO/R模型制备过程中缺血侧脑血流量下降百分比在41%～50%之间模型效果最佳,MCAO/R模型成功率高、重复性及稳定性好。2.补阳还五汤可以通过降低脑组织中蛋白Tf R1、DMT1的表达,增强FPN1、GPX4的表达,降低大鼠缺血再灌注侧半暗带区脑组织中的铁离子含量,抑制了因过量铁参与芬顿反应产生的活性氧及随后的有毒脂质过氧化物蓄积引起的铁死亡,减轻CIRI,促进脑组织神经功能的恢复。3.补阳还五汤可通过降低缺氧缺糖/复氧复糖HT22细胞中蛋白Tf R1、DMT1表达水平,增强FPN1、GPX4的表达,降低细胞中的Fe~(2+)含量,减少细胞中ROS、MDA的产生,从而抑制铁死亡,减轻OGD/R模型HT22细胞损伤,促进神经功能恢复。