研究背景:多形性胶质母细胞瘤(Glioblastoma multiforme,GBM)是恶性程度最高的颅内肿瘤,占原发性脑肿瘤的17%,全球每年约有10万名被诊断为高级别或恶性GBM患者,其中位生存期小于1年。目前对GBM的常规治疗方案为手术切除与放化疗结合。尽管手术切除、放疗、化疗、免疫疗法和光热治疗(Photothermal therapy,PTT)等对GBM治疗具有一定疗效,但GBM患者的预后仍较差,其原因主要与GBM细胞增殖迅速造成术后复发,GBM细胞对化疗产生耐药性以及某些药物难以穿越血脑屏障(Blood brain barrier,BBB)和血肿瘤屏障(Blood tumor barrier,BTB)等密切相关。大量临床和基础研究均证实单一治疗策略常诱导GBM产生抗性,很难达到最佳治疗效果。因此,联合肿瘤靶向治疗和PTT的方案对治疗GBM具有潜在的临床应用前景。石墨炔(Graphdiyne,GDY)是迄今为止发现的唯一含有sp杂化碳原子的碳同素异构体,虽然近年来GDY在能源储存和催化等领域的应用研究取得了一定的进展,但与石墨烯等二维碳纳米材料相比,GDY尚未被深入研究和广泛应用。值得关注的是,GDY是一种具有载药能力和可修饰性的光热材料,通过π-π堆叠共轭吸附含有芳香烃或类芳香烃结构的小分子,具备肿瘤靶向和PTT治疗的潜力。研究表明,受体—配体识别是肿瘤靶向治疗的关键环节,其中低密度脂蛋白受体相关蛋白-1(Low-density lipoprotein receptor-related protein-1,LRP-1)是一种高表达于脑毛细血管和肿瘤新生血管内皮细胞以及GBM细胞的膜蛋白受体,利用LRP-1的配体—受体相关蛋白(Receptor-associated protein,RAP)作为修饰纳米载体的功能性靶头,能有效递送药物透过BBB增加GBM组织中药物含量,提示以RAP修饰的纳米载体递送GBM靶向治疗药物具有可行性。铁死亡(Ferroptosis)是一种铁依赖的以氧化损伤为特征的细胞死亡方式,谷胱甘肽过氧化物酶4(Glutathione peroxidase,GPX4)是参与调控铁死亡的重要分子,能通过下调细胞脂质过氧化反应抑制铁死亡,FIN56是一种特异性的GPX4抑制剂,通过诱导GPX4降解而使细胞产生大量活性氧(Reactive oxygen species,ROS),导致线粒体结构损坏和细胞能量代谢紊乱,最终促进铁死亡。基于此,本论文以GDY为药物载体和光热转换材料,利用FIN56诱导铁死亡的特性和RAP靶向性能,构建具有透过BBB与BTB,和GBM靶向递药能力以及光热转换性能的纳米载药体系,评价该体系联合PTT对GBM细胞铁死亡的促进作用,并对其分子机制进行了深度解析。材料与方法:采用三步法组装GDY、FIN56和RAP以制备GDY-FIN56-RAP(GFR)自组装纳米载药体系。应用透射电子显微镜和原子力显微镜表征纳米载药体系形态、尺寸和厚度,动态光散射表征纳米载药体系水合粒径分布,红外成像仪表征纳米载药体系光热性能。在体外细胞实验中,应用CCK8法检测纳米载药体系对GBM细胞活力的影响,Ed U法检测纳米载药体系对GBM细胞增殖的影响,活/死细胞染色检测纳米载药体系对GBM细胞杀伤作用,Western blot检测铁死亡与铁代谢相关蛋白水平,流式细胞术检测细胞ROS水平,生化试剂盒检测细胞内脂质过氧化产物丙二醛(Malondialdehyde,MDA)和还原型谷胱甘肽(Glutathione,GSH)含量,透射电子显微镜检测线粒体形态,体外BTB模型检测GFR穿透BTB能力。在体内实验中,选用4周龄雌性裸鼠,将表达荧光素酶的LN229细胞接种于右脑纹状体,构建原位GBM模型小鼠。应用质谱成像显微镜(i MScope)检测GFR穿过BBB和BTB的能力和靶向递药能力。为评估GFR体内抗GBM效果,运用Western blot检测GPX4蛋白表达水平,流式细胞术检测肿瘤组织ROS含量,生化试剂盒检测组织MDA和GSH含量,免疫荧光检测8-羟基鸟苷(8-hydroxy-2-deoxyguanosine,8-OHd G)水平和分布,小动物体内成像系统(In vivo imaging system,IVIS)监测GBM生长情况。结果:(1)GDY-RAP纳米片,厚度为14.5 nm,水合粒径集中分布于220 nm,zeta电位约为15 m V。(2)随着FIN56/GR投料比的增加,GFR载药量高达47.16±3HDAC抑制剂.18%,在投料比增加至3时,载药量进入体系期,包封率从68.25±0.72%降至18±2.28%。(3)GFR纳米载药体系为片状结构,厚度为16.9 nm,水合粒径集中分布于255 nm,zeta电位约为9 m V。(4)808 nm激光照射使GFR分散溶液的温度以剂量依赖的方式显著升高,4次激光开关循环显示GFR具有良好的光热稳定性。808nm激光照射显著诱导GFR在酸性条件下释放更多的FIN56。(5)在LN229和T98G细胞中,FIN56以剂量依赖的方式诱导细胞活力降低。GFR显著降低细胞PUN30119核磁活力,GFR联合808 nm激光照射进一步降低细胞活力。(6)808 nm激光照射促进GFR诱导的GBM细胞死亡。(7)GFR纳米载药体系通过降低GPX4蛋白水平,促进细胞ROS水平升高,诱导GBM细胞氧化-还原失衡。(8)808 nm激光照射促进GFR诱导的GBM细胞铁死亡。(9)在8 h内GFR不显著破坏体外BTB屏障结构。(10)GFR有效透过体外BTB模型,降低GBM细胞GPX4水平。(11)i MScope结果显示,GFR纳米载药体系能将FIN56快速并特异性的递送至GBM组织。(12)FIN56在体内的生物分布显示,GFR能高效递送FIN56至GBM组织,并延长FIN56在GBM组织内的滞留时间。(13)GFR在体内保持良好的光热性能,808 nm激光照射诱导模型小鼠肿瘤部位温度升高。(14)GFR纳米载药体系联合808 nm激光照射抑制GBM生长。(15)GFR纳米载药体系联合808 nm激光照射延长荷瘤小鼠寿命。(16)GFR、GR联合808 nm激光照射和GFR联合808 nm激光照射显著改善荷瘤小鼠的神经功能和运动能力。(17)GFR治疗联合近红外光照射,促进GBM组织内GPX4降解和线粒体损伤。(18)GFR纳米载药体系联合808 nm激光照射促进模型小鼠GBM铁死亡,更显著的抑制GBM生长并延长小鼠寿命。(19)实验中制备的纳米载药体系在给药剂量下未造成显著溶血,对小鼠主要脏器未见明显病理损伤。结论:本研究首次构建了装载FIN56的GBM靶向石墨炔纳米载药体系GFR;证实了GFR通过其靶头RAP与LRP-1特异性结合将GFR靶向递送入脑直至GBM细胞,进而杀伤GBM细胞;阐明了GFR联合PTT治疗通过降低GBM细胞内GPX4水平促进细胞铁死亡的分子机制。研究结果不仅为GFR对GBM的潜在临床应用奠定基础,而且为进一步拓展GDY在Water microbiological analysis生物医学领域的应用提供科学依据。