转录水平调控和转录后水平调控是细菌协调基因表达的重要手段/方式。转录水平是指在基因转录过程中通过调控启动子、转录相关因子等来调节RNA的初始合成效率和数量进而实现对基因的表达调控,而转录后水平调控主要通过对初始转录的RNA进行修饰和加工,进而限制mRNA分子的拷贝数来调节蛋白质的合成。因此,与转录水平相比,转录水平后调控为细菌提供了一种更节省时间和能量的调控方式,从而满足细胞特定的生理功能,促使细菌能够快速适应周围环境条件的改变以维持自身的生存。嗜中温、厌氧的解纤维梭菌(Ruminiclostridium cellulolyticum),能够分泌产生一种高分子量的多酶复合体,即纤维小体,来高效降解木质纤维素。纤维小体是由纤维素酶或半纤维素酶亚基所含的锚定域(Dockerin)与支架蛋白上的黏附域(Cohesin)相互作用组装而成。在R.cellulolyticum中,cip-cel基因簇由cip C和cel48F等12个编码纤维小体关键亚基的基因组成。我们前期研究发现,R.cellulolyticum通过转录后水平选择性RNA剪切和保护机制(selective RNA processing and stabilization,SRPS)调控cip-cel基因簇中编码不同纤维素酶基因的差异表达,赋予纤维小体特定的化学计量比来高效降解木质纤维素。但是,对于纤维小体中各酶亚基Liraglutide半抑制浓度不同比例的的具体调节机制仍需进一步阐述。因此,为了揭示SRPS机制在cip-cel mRNA加工调控中的具体作用方式,本研究以R.cellulolyticum为研究对象,在转录后水平系统分析cip-cel mRNA中潜在的所有剪切加工位点以及调控RNA剪切加工的关键元素,主PD0325901生产商要研究结果如下。首先,全面分析确定cip-cel mRNA中的剪切加工事件。在R.cellulolyticum清楚的遗传背景和本实验室成熟的遗传操作系统基础上,我们基于实验室已有的Fb FP(绿色荧光蛋白)和m Cherry(红色荧光蛋白)的双荧光报告系统,构建包含有cip-cel基因簇中11个基因间隔区(Intergenic regions,IRs)的转化子并进行Northern blotting分析,成功鉴定了簇中潜在的6个转录后剪切加工位点(Processing sites,PSs),分别位于第1,2,4,5,7和10基因间隔区中(命名为IR1,IR2,IR4,IR5,IR7和IR10)。其次,精确定位IRs中的RNA剪切加工位点。我们开发了基于花菁染料Cy5.5标记的引物延伸法以及基于第二代测序技术的高通量测序方法,分别对cipcel基因簇中存在的剪切加工位点进行了精确定位。结果显示来自cip-cel mRNA中的6个剪切加工位点主要位于颈环结构上下游的单链区域。两种方法不仅能够精确定位cip-cel基因簇中的RNA剪切加工位点,而且具有更高的安全性和检测效率,能够满足一般实验室的实验要求。将为在转录后水平精确探究转录起始位点或RNA剪切加工位点提供更加安全可靠的分子生物学技术。再次,探究颈环结构对RNA剪切加工以及加工后转录本稳定性的影响。利用Mfold软件成功预测到能够发生剪切的6个IRs中均包含颈环结构,且剪切加工位点主要分布于颈环结构上下游一定距离处。此外,IRs所包含的颈环结构的突变分析显示,颈环结构的破坏或删除严重抑制了RNA剪切加工的发生,同时使得转录本的稳定性也急剧下降。因此,颈环结构在cip-cel基因簇转录后水平的加工调控中不仅作为剪切识别信号诱导核糖核酸酶在特定位点处对RNA进行剪切加工,而且作为保护性元件对加工后转录本的稳Intra-abdominal infection定性进行调控。该结果将为深入阐释颈环结构在细菌SRPS机制中的调控作用奠定基础,同时也为体外人工设计调节性颈环结构提供理论基础。最后,系统分析调控颈环结构功能发挥的结构基础。综合分析6个IRs所包含颈环结构的结构特征,将其分为三类。Ⅰ)颈环结构具有完美配对的双链区域,如IR1-SL,IR5-SL和IR10-SL;Ⅱ)颈环结构含有较多非配对区域,如IR2-SL和IR7-SL;Ⅲ)颈环底部存在AT富集区,如IR4-SL。我们以不同类型颈环结构中的特异性区域为突破口,通过对其进行一系列删除或点突变构建重组载体后分析发现,Ⅰ型和Ⅱ型颈环结构所包含的GC-pair区能够调控颈环结构剪切功能的发挥。而对于Ⅲ型颈环底部的AT-pair区,主要与其所属颈环结构上游的特异性颈环结构共同控制RNA剪切位点的定位。该发现不仅对参与cip-cel mRNA剪切加工的颈环结构的结构基础进行了深入探究,同时也为作用于cip-cel基因簇转录后水平加工调控的核糖核酸酶的鉴定提供新的研究思路。本研究精确鉴定了cip-cel簇中潜在的所有转录后剪切加工位点,解析了颈环结构在调控RNA剪切与维持转录本稳定性中的关键作用,获得了调节颈环结构功能发挥的关键结构基础和碱基序列,明确了GC-pair区对颈环结构剪切功能的重要调控机制,最终阐明了R.cellulolyticum在转录后水平通过SRPS对cip-cel基因簇中各基因差异表达调控的分子机制。这些工作将为后续进一步探究纤维小体表达调控机制及其组装研究奠定了理论基础,同时也为阐释细菌转录后水平RNA的剪切调控机制提供了新的思路,对今后设计调控基因表达的合成生物学工以及人工组装超级纤维小体具有重要的生物学意义。