目的:肺癌是全球癌症发病和死亡的主要原因,造成巨大的公共卫生负担。有效的早期诊断是减少肺癌相关死亡和改善患者预后的重要防控目标。以铂类为基础的化疗目前仍旧是肺癌的一线疗法,但频繁的耐药和复发等不良临床事件的发生为肺癌的预后带来巨大挑战。因此,深入研究肺癌的发生发展机制以鉴定其中的关键分子事件,积极探寻有助于早期诊断和预后的生物标志物以及潜在的干预靶点,对于实现肺癌的三级预防具有十分重要的公共卫生意义。吸烟是肺癌最主要的危险因素,烟草烟雾中以苯并(a)芘为代表的多环芳烃类致癌物与肺癌的发生发展密切相关。肺癌通常是环境和遗传因素交互作用下驱动的产物。全基因组关联性研究和流行病学证据表明人类19号染色体长臂1区3带(19q13)遗传或表观遗传变异与肺癌的发病风险及预后结局密切相关。FBJ鼠骨肉瘤病毒癌基因的同源物B(FBJ Murine Osteosarcoma Viral Oncogene Homolog B,FOSB)是位列19q13的基因之一,其编码的蛋白作为核转录因子发挥生物学功能。近年来有关FOSB在肺癌发生发展及预后中的作用存在争议,具体机制也尚未完全阐明。我们在前期研究中发现,转录因子FOSB在多环芳烃诱导肺上皮细胞恶性转化和吸烟相关肺癌组织中的表达显著下调,提示其可能作为潜在的肿瘤抑制因子参与烟草烟雾暴露诱导的肺部癌变。有趣的是,生存分析表明FOSB在TP53基因不同突变状态的肺癌组织中的表达指示截然相反的预后,提示TP53基因突变状态可能作为一种关键的分子开关导致FOSB在肺癌细胞中的肿瘤生物学效应发生转变。因此,本研究提出应以TP53基因突变状态为特定遗传背景,系统探讨转录因子FOSB在多环芳烃所致肺癌变中的表达特征及其在肺癌恶性进展和基于铂类治疗的预后中的具体作用及潜在分子机制,Strongyloides hyperinfection为鉴定吸烟相关肺癌易感、诊断和预后更加确切的生物标志物以及潜在的治疗靶点提供新的科学线索和独特的机制见解。研究方法:1.使用课题组建立的BPDE诱导的人肺支气管上皮细胞16HBE恶性转化模型,RT-q PCR和Western Blot分别检测恶性转化过程中FOSB m RNA和蛋白表达水平的变化。2.RT-q PCR和Western Blot分别检测人正常肺上皮细胞系和NSCLC细胞系中FOSB m RNA和蛋白的差异表达。3.利用TCGA数据库NSCLC队列分析FOSB m RNA在吸烟相关NSCLC组织和癌旁组织中的差异表达及其表达与NSCLC患者临床病理特征和预后之间的关联性。4.RT-q PCR和Western Blot分别检测吸烟相关肺癌组织和配对的癌旁组织中FOSB m RNA和蛋白的差异表达。5.采用分子克隆技术构建p53-WT、p53-R175H、p53-R248W、p53-R248L、p53-R248Q、p53-R273H和p53-R273L过表达质粒(和元生物,中国),琼脂糖凝胶电泳及Sanger测序(生工公司,中国)对产物的突变位点进行验证。6.野生型p53和不同位点突变型p53质粒转染p53表达缺失的H1299肺癌细胞,RT-q PCR和Western Blot分别检测p53及其下游靶标P21、PUMA m RNA和蛋白表达水平。7.在表达野生型p53和不同位点突变型p53的H1299细胞中转染FOSB过表达质粒(和元生物,中国),RT-q PCR和Western Blot分别检测FOSB m RNA和蛋白表达水平。8.CCK-8法检测FOSB过表达对不同TP53突变类型的H1299细胞增殖能力的影响。9.克隆形成实验检测FOSB过表达对不同TP53突变类型的H1299细胞独立生存能力的影响。10.划痕实验和Transwell迁移实验检测FOSB过表达对不同TP53突变类型的H1299细胞迁移能力的影响。11.Matrigel基质胶包被的Transwell侵袭实验检测FOSB过表达对不同TP53突变类型的H1299细胞侵袭能力的影响。12.CCK-8法检测FOSB过表达对不同TP53突变类型的H1299细胞顺铂敏感性的影响。13.流式细胞术检测FOSB过表达对顺铂诱导的不同TP53突变类型的H1299细胞凋亡的影响。14.构建FOSB过表达的H1299(p53-Null)、H1299(p53-WT)和H1299(p53-R248Q)转染细胞后进行转录组测序(联川生物,中国),火山图可视化差异表达基因(DEGs)。15.对上述三种FOSB过表达转染细胞中上调的DEGs集进行生物学富集分析(GO分析),气泡图可视化富集分析的结果。16.RT-q PCR和Western Blot分别检测FOSB过表达对H1299(p53-Null)、H1299(p53-WT)、A549(p53-WT)、H1299(p53-R248Q)和PC-9(p53-R248Q)肺癌细胞中候选的FOSB转录调控靶标及其下游信号通路的影响。17.使用si RNA介导的RNA干扰技术沉默候选的FOSB转录调控靶标后测定肿瘤生物学表型的变化:CCK-8法检测细胞的增殖能力;克隆形成实验检测细胞的独立生存能力;划痕实验及Transwell迁移实验检测细胞的迁移能力;Matrigel基质胶包被的Transwell侵袭实验检测细胞的侵袭能力;CCK-8法检测细胞的顺铂敏感性。18.使用si RNA介导的RNA干扰技术沉默A549细胞中内源性野生型p53,RT-q PCR和Western Blot分别检测FOSB过表达对下游相关指标m RNA和蛋白水平的影响。19.使用si RNA介导的RNA干扰技术沉默PC-9细胞中内源性突变型p53-R248Q,RT-q PCR和Western Blot分别检测FOSB过表达对下游相关指标m RNA和蛋白水平的影响。20.使用Gene MANIA数据库构建以FOSB和p53为中心枢纽的蛋白-蛋白互作网络。21.Co-IP实验检测H1299(p53-WT)、A549(p53-WT)、H1299(p53-R248Q)和PC-9(p53-R248Q)肺癌细胞中FOSB与内源或外源性野生型p53或突变型p53-R248Q之间的蛋白-蛋白相互作用。22.JASPAR数据库预测PREX1、IGFBP5、AKR1C3和ALDH3A1基因启动子中转录因子FOSB潜在的结合位点。23.Ch IP-q PCR实验验证转录因子FOSB与候选靶基因PREX1、IGFBP5、AKR1C3和ALDH3A1启动子序列的直接结合以及p53状态的切换对FOSB与上述靶基因启动子结合能力的影响。结果:1.转录因子FOSB在BPDE诱导肺上皮细胞恶性转化和吸烟相关肺癌组织中表达的分子特征:(1)FOSB m RNA和蛋白表达水平在BPDE诱导肺上皮细胞恶性转化、非小细胞肺癌(NSCLC)细胞系和吸烟相关NSCLC组织中均显著下调(P<0.05)。(2)FOSB在肺腺癌(LUAD)和肺鳞癌(LUSC)中的表达指示截然相反的预后:FOSB高表达在吸烟相关LUAD中指示更长的总生存期(OS)且与积极的临床病理特征相关联(P<0.05),而在吸烟相关LUSC中则完全相反(P<0.05)。(3)NSCLC中TP53基因的突变率存在显著差异:其在LUAD中约为50%,在LUSC中则超过85%。(4)FOSB在NSCLC中表达的预后效应依赖于TP53基因的突变状态:在野生型TP53遗传背景下,FOSB高表达指示更长的OS且与积极的临床病理特征和预后指数相关联(P<0.05);在突变型TP53遗传背景下,FOSB高表达指示更短的OS且与不良的临床病理特征和预后指数相关联(P<0.05)。2.转录因子FOSB对携带不同TP53突变类型H1299肺癌细胞恶性生物学行为及顺铂敏感性的影响:(1)在p53缺失(p53-Null)的H1299细胞中,FOSB过表达促进细胞增殖(P<0.05)和克隆形成能力(P<0.05);在表达野生型p53(p53-WT)的H1299细胞中,FOSB过表达抑制细胞增殖(P<0.05)和克隆形成能力(P<0.05);在表达突变型p53-R175H、p53-R248Q及p53-R273L的H1299细胞中,FOSB过表达促进细胞增殖(P<0.05)和克隆形成能力(P<0.05)。(2)在p53缺失(p53-Null)的H1299细胞中,FOSB过表达促进细胞的迁移和侵袭能力(P<0.05);在表达野生型p53(p53-WT)的H1299细胞中,FOSB过表达抑制细胞的迁移和侵袭能力(P<0.05);在表达突变型p53-R175H、p53-R248Q和p53-R273L的H1299细胞中,FOSB过表达促进细胞的迁移和侵袭能力(P<0.05)。(3)在表达野生型p53(p53-WT)的H1299细胞中,FOSB过表达提高肿瘤细胞的顺铂敏感性(P<0.05);在表达突变型p53-R248Q的H1299细胞中,FOSB过表达降低肿瘤细胞的顺铂敏感性(P<0.05)。(4)在表达野生型p53(p53-WT)的H1299细胞中,FOSB过表达促进顺铂诱导的细胞凋亡(P<0.05);在表达突变型p53-R248Q的H1299细胞中,FOSB过表达抑制顺铂诱导的细胞凋亡(P<0.05)。3.转录因子FOSB以p53依赖性方式调节肺癌细胞恶性生物学行为及顺铂敏感性的分子机制:(1)FOSB过表达在H1299(p53-Null)、H1299(p53-WT)和H1299(p53-R248Q)三种肺癌细胞中引起独特的转录组学变化。(2)生物学富集分析结合RT-q PCR实验验证筛选出PREX1是FOSB在p53缺失的肺癌细胞中特异的转录调控靶标(P<0.05);IGFBP5是FOSB在表达p53-MS-275化学结构WT的肺癌细胞中特异的转录调控靶标(P<0.05);AKR1C3和ALDH3A1是FOSB在表达p53-R248Q的肺癌细胞中特异的转录调控靶标(P<0.05)。(3)在p53-Null的肺癌细胞中,FOSB过表达特异性上调PREX1并激活其下游RAC1-ERK/AKT致癌信号通路(P<0.05),沉默PREX1阻断FOSB过表达对下游RAC1/ERK/AKT致癌信号通路激活(P<0.05);在表达p53-WT的肺癌细胞中,FOSB过表达特异性上调IGFBP5并激活其下游p53信号通路和抑制ERK/AKT致癌信号通路(P<0.05),沉默IGFBP5阻断FOSB过表达对下游p53信号通路的激活及ERK/AKT致癌信号通路的抑制(P<0.05);在表达p53-R248Q的肺癌细胞中,FOSB过表达特异性上调AKR1C3和ALDH3A1并激活其下游ERK/AKT致癌信号通路(P<0.05),沉默AKR1C3阻断FOSB过表达对下游ERK/AKT致癌信号通路的激活(P<0.05)。(4)FOSB过表达显著促进H1299(p53-Null)肺癌细胞的增殖、迁移和侵袭性(P<0.05),沉默PREX1阻断FOSB过表达对肺癌细胞恶性生物学行为的促进作用(P<0.05);FOSB过表达显著抑制H1299(p53-WT)和A549(p53-WT)肺癌细胞的增殖、迁移和侵袭性并提高其顺铂敏感性(P<0.05),沉默IGFBP5阻断FOSB过表达对肺癌细胞恶性生物学行为的抑制及顺铂敏感性促进作用(P<0.05);FOSB过表达显著促进H1299(p53-R248Q)和PC-9(p53-R248Q)肺癌细胞的增殖、迁移和侵袭性并降Nirmatrelvir半抑制浓度低其顺铂敏感性(P<0.05),沉默AKR1C3阻断FOSB过表达对肺癌细胞恶性生物学行为的促进及顺铂敏感性的抑制作用(P<0.05)。(5)沉默A549细胞中的内源性p53-WT导致FOSB的转录靶标由IGFBP5向PREX1转变(P<0.05);沉默PC-9细胞中的内源性p53-R248Q导致FOSB的转录靶标由AKR1C3和ALDH3A1向PREX1转变(P<0.05)。(6)Co-IP实验显示使用FOSB特异性抗体或p53特异性抗体进行免疫共沉淀均能检测到FOSB与内源或外源性p53-WT和p53-R248Q之间的蛋白-蛋白互作。(7)在H1299(p53-Null)肺癌细胞中,只检测到FOSB与PREX1启动子的直接结合(P<0.05);在H1299(p53-WT)肺癌细胞中,p53-WT过表达导致FOSB与PREX1启动子结合能力的减弱(P<0.05)并促进其与IGFBP5启动子的结合(P<0.05);在H1299(p53-R248Q)肺癌细胞中,p53-R248Q过表达导致FOSB与PREX1启动子结合能力的减弱(P<0.05)并促进其与AKR1C3(P<0.05)和ALDH3A1(P<0.05)启动子的结合。结论:转录因子FOSB在多环芳烃诱导肺上皮细胞恶性转化和吸烟相关肺癌组织中表达下调,其高表达指示野生型TP53肺癌患者预后良好,突变型TP53肺癌患者预后不良。在TP53缺失遗传背景下,转录因子FOSB通过PREX1调节下游RAC1-ERK/AKT致癌信号通路促进肺癌细胞的恶性生物学行为;在野生型TP53遗传背景下,其通过IGFBP5调节下游p53信号通路和ERK/AKT致癌信号通路抑制肺癌细胞的恶性生物学行为并提高其顺铂敏感性;在突变型TP53-R248Q遗传背景下,其通过AKR1C3/ALDH3A1调节下游ERK/AKT致癌信号通路促进肺癌细胞恶性生物学行为并降低其顺铂敏感性。野生或突变型p53通过与FOSB建立直接的蛋白-蛋白互作,引导FOSB识别并结合不同的启动子序列以转录激活特定靶基因的表达,从而对肺癌的进展及预后产生不同的影响。