失忆性贝类毒素软骨藻酸(Domoic acid)是一种强效神经毒素和谷氨酸激动剂,是主要由拟菱形藻属(Pseudo-nitzschia)和菱形藻属(Nitzschia)的硅藻产生的海洋生物毒素。DA在全球海域广泛分布,其毒性强、作用快、缺乏解毒剂,能够导致人类呕吐、腹泻、意识混乱、记忆丧失甚至死亡。随着近海有害藻华(Harmful algal bloom,HAB)的频发,DA在海水及海产品中积聚的风险随之增加,对生态环境、人类健康、社会经济造成严重威胁。目前开发的DA检测分析方法主要有高效液相色谱法、免疫分析法、毛细管电泳法等,其虽各具优势,但仍具有设备繁琐、操作复杂、耗时较长、特异性差等局限性。仍需建立更加快速、高效、特异的DA检测手段。新型的分子识别元件核酸适配体为DA的分析检测带来启示。适配体一般由指数富集的配体系统进化(Systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX)技术筛选获得,具有亲和力高、特异性强、易于修饰固定、合成成本低等诸多优势。目前很少有关于DA适配体的报道,鉴于其分子量极小、不适于经典的靶标固定型SELEX等因素,本研究采取2种文库固定型SELEX技术平行筛选DA的核酸适配体。借助克隆GSK1349572测序及高通量测序(High-throughput sequencing,HTS)、生物信息学分析、生物膜干涉(Biolayer interferometry,BLI)技术,选择高亲和力适配体。基于二级结构预测、三维结构建模、分子对接和分子动力学(Molecular dynamics,MD)模拟的结果,对适配体进行结合机制探究和截短优化。最终利用与DA高亲和力、高特异性结合的2条最优适配体分别制备基于BLI的生物传感器,并将其初步应用于实际样品的检测。本研究的主要结果如下。本研究采取捕获SELEX和全新的二氧化锰SELEX平行筛选DA的适配体。不仅有利于维持靶标DA的天然结构,还可避免背景吸附所导致的寡核苷酸非特异性富集。同时引入DA的结构类似物红藻氨酸(Kainic acid,KA)作为反向筛选靶标,以增强筛选特异性。捕获SELEX借助生物素标记的捕获序列,将ssDNA文库固定于链霉亲和素(Streptavidin,SA)磁珠上,使溶解在缓冲液中的DA与固定的文库孵育并将结合的序列洗脱。经过12轮的筛选,保留率进入平台期,达到筛选终点。此外,本研究利用二氧化锰纳米片对于ssDNA的物理吸附作用,实现ssDNA文库的高效固定,建立了全新的二氧化锰SELEX技术。该方法的文库固定效率高达99%以上。该方法极高的文库固定效率强化了自身的筛选压力,既能减少体系中微量游离ssDNA对筛选造成的干扰,也能尽量避免无亲和力及低亲和力的寡核苷酸被靶标洗脱,具有更高的筛选效率,经过9轮筛选即达到筛选终点。将2种筛选方法获得的产物进行克隆测序和HTS分析,结果表明,序列随SELEX过程得到有效富集且序列多样性降低。利用Clustal X 2更多.1、mfold等软件分别对测序数据进行同源性分析、二级结构预测和吉布斯自由能预测。借助BLI技术在候选适配体中选取亲和力最高的C1(K_D值1.69×10~(-6)M)和M70(K_D值4.82×10~(-7)M)分别作为2种筛选方法所得最优适配体。将适配体C1的引物序列去除后得到C1-s,其亲和力仅有少许提高;基于mfold二级结构预测模型,将C1-s截短得到4条潜在适配体,其中C1-d(K_D值1.09×10~(-7) M)的亲和力提高最为显著。将适配体M70(K_D值4.82×10~(-7)M)的引物序列截去后获得M70-s,其亲和力(K_D值1.26×10~(-7) M)具有明显提高。此外,QGRS mapper表明M70-s可以形成G-四链体结构,因此基于mfold的截短过程对M70-s优化难度较大。通过BLI验证,C1-d和M70-s均具有对DA的高亲和力和强特异性,是初步截短优化后的最佳选择。为探究适配体与DA的相互作用机制和关键位点,同时为适配体的进一步优化提供参考。对适配体C1-s、C1-d和M70-s进行三维结构建模并将其与DA进行分子对接和MD模拟。分子计算的结果表明,DA与C1-s中的3个碱基形成氢键相互作用,C1-s-DA的结合自由能为-13.51 kcal/mol。C1-d中有5个碱基与DA形成氢键相互作用,C1-d-DA复合物的结合自由能为-21.90 kcal/mol。与C1-s-DA相比,C1-d-DA的结合自由能明显更低。结合自由能越低,提示适配体对靶标的亲和力越高。均方根偏差(Root mean square deviation,RMSD)监测结果表明,复合物C1-d-DA比C1-s-DA更快达到稳定状态。C1-d-DA的构象变化、回旋半径和质心距离数据表明,C1-d在模拟过程中逐渐聚拢,与DA紧密结合从而形成更多的氢键。揭示了截短适配体C1-d相较于原适配体C1-s的亲和力显著提高的原因。在适配体M70-s中,由G_8-G_(13)-G_(30)-G_(35),G_9-G_(14)-G_(31)-G_(36),G_(10)-G_(15)-G_(32)-G_(37)三个G-四分体堆积形成G-四链体结构。M70-s中有5个G碱基与DA形成氢键相互作用,M70-s-DA的结合自由能为-20.98kcal/mol。M70-s-DA的RMSD数值、回旋半径和质心距离变化整体波动不大,体现了M70-s与DA结合的高度稳定。相比之下,M70-s和C1-d与DA复合物的结合自由能相近,形成氢键数目相同,但C1-d与DA生成氢键的距离较短,所以C1-d-DA结合自由能比M70-s-DA略低。基于分子计算的结果并参照mfold提供的结构信息,对适配体C1-d和M70-s保留核心序列并去除部分非必需核苷酸后,进一步截短获得结合速率升高、解离速率降低、亲和力提升的适配体C1-f(K_D值9.46×10~(-8) M)和M70-b(K_D值8.31×10~(-8) M),有利storage lipid biosynthesis于后续的应用研究。基于灵敏、实时的BLI分子互作平台,利用DA的高亲和力适配体C1-f和M70-b构建生物传感器。将适配体C1-f和M70-b分别耦合在超级链霉亲和素(Super streptavidin,SSA)传感器上,设定传感器平衡、靶标结合、靶标解离等程序后即可实现样品检测。传感器C1-f的检出限(Limit of detection,LOD)为7.23 n M,定量限(Limit of quantitation,LOQ)为24.10 n M,线性范围在200～4000 n M,组内相对标准偏差(Relative standard deviation,RSD)为0.60%～2.83%,组间RSD为1.60%～3.62%。传感器M70-b的LOD为5.79 n M,LOQ为19.31 n M,线性范围在100～4000n M,组内RSD为0.53%～2.25%,组间RSD为0.78%～3.39%。上述2个适配体传感器具有较低的LOD、LOQ,较宽的线性范围,较高的精密度以及高特异性,在含有其他类型海洋生物毒素干扰的环境中也可以用于DA的检测。同时,传感器还具有良好的重复性,可重复使用至少10次。仅在10 min内即可完成一次检测。传感器C1-f在海水和贝肉样品检测中的回收率为分别为90.33%～100.74%和92.42%～103.27%,传感器M70-b在海水和贝肉样品检测中的回收率为分别为96.22%～111.46%和97.30%～113.80%。本研究制备的适配体传感器具有良好性能,在实际样品检测中均具有较高的回收率和准确度,能够实现对DA快速、实时、灵敏、特异的检测。综上所述,本研究提供了2条对DA具有高亲和力和高特异性的分子识别元件;建立了一种新型、高效且免除靶标固化的适配体筛选技术;首次探究了DA与适配体的结合机制,为适配体的优化提供新思路和理论基础;首次制备了DA的BLI适配体传感器,为DA的快速检测提供技术储备,并有望为生态环境、食品安全、人类健康作出贡献。