生物体中的基因组DNA会受到来自细胞内源或外源的因素作用而产生损伤,导致基因组的不稳定,诱发癌症和多种疾病的发生。Srx1是酿酒酵母中的一种内源性抗氧化蛋白,可以抵抗由活性氧诱导的氧化应激,其抗氧化功能在疾病的发生过程中发挥了重要的作用。活性氧导致的DNA损伤类型有很多,包括碱基修饰、碱性位点、DNA蛋白质交联和DNA链断裂,真核细胞对这些损伤的应答方式包括DNA损伤修复途径和DNA检查点机制,其中损伤修复途径包括碱基切除修复、核苷酸切除修复、同源重组和非同源末端连接。目前对于Srx1在DNA损伤及修复过程中是否发挥了重要作用尚不清楚。本研究以酿酒酵母为模型生物,探讨酿酒酵母中Srx1对DNA损伤应答和修复的调控作用及其分子机制。首先通过基因敲除在野生型菌株W303中构建Srx1以及其他8个DNA损伤修复相关基因的突变体(以Srx1为例,Srx1代表Srx1蛋白;Srx1代表Srx1基因;srx1Δ代表Srx1基因已被敲除)。然后通过药物敏感性实验检测srx1Δ对不同DNA损伤剂的敏感性,结果显示长期暴露于DNA损伤剂时,srx1Δ对DNA双链断裂损伤剂博来霉素敏感,对羟基脲导致的复制压力、甲磺酸甲酯导致的烷基化损伤、喜树碱导致的单链断裂和4-硝基喹啉-1-氧化物导致的氧化应激损伤不敏感;进一步通过亚甲基紫染色检测在瞬时博来霉素处理下细胞死亡率,结果显示srx1Δ与野生型W303相比,细胞存活率下降,表明无论处在长期还是瞬时的DNA双链断裂损伤下,Srx1都发挥了重要的作用。通过实时荧光定量PCR检测DNA损伤率,结果显示在博来霉素处理下,srx1Δ菌株DNA双链断裂的损伤率增加,表明Srx1参与DNA双链断裂的损伤修复过程。DNA双链断裂损伤的修复方式主要通过断裂末端是否发生切除进行选择,如果末端发生切除,则通过同源重组途径对损伤进行修复。切除Talazoparib溶解度的起始是由Mre11-Rad50-Xrs2(MRX)复合物和核酸酶Sae2合作引发的,接着由核酸酶Exo1和Sgs1进行远程切除。为了探究Srx1是否参与末端切除,通过药物敏感性实验检测srx1Δsgs1Δ、srx1Δsae2Δ、srx1Δexo1Δ对博来霉素敏感性,结果显示均与srx1Δ对博来霉素的敏感性相同,当两个基因位于同一条通路时,单敲除通路基因效应与双敲除相似,表明Srx1和Exo1、Sgs1、Sae2作用于同一条途径,说明Srx1参与末端切除过程,推测作用于Sae2上游。进一步通过酵母双杂交检测蛋白之间相互作用,结果表明Srx1和Mre11、Sae2之间存在相互作用关系从而参与末端切除。由于断裂末端切除后链交换蛋白Rad51结合到切除产生的单链DNA上,进行同源搜索和链入侵修复损伤,本研究通过激光共聚焦显微镜检测Rad51聚焦点的形成,结果发现srx1Δ的末端切除缺陷抑制了Rad51在同源重组过程中在单链DNA上的聚集,表明Srx1参与末端切除从而促进同源重组修复双链断裂损伤。双链断裂损伤会激活DNA损伤检查点途径,损伤检查点是由传感器激酶Mec1感知损伤信号,并经过介质蛋白Rad9传递信号到效应激酶Rad53,Rad53磷酸化使检查点激活。本研究探讨了Srx1在DNA损伤检查点中的功能,通过Western Blot检测损伤和修GSK1120212体内复过程中Rad53的磷酸化,发现srx1Δ的Rad53磷酸化程度一直高于野生型,表明srx1Δ中过多的DNA双链断裂损伤导致Rad53过度磷酸化,而且rad9Δ在W303和srx1Δ细胞中的Rad53磷酸化减少,说明Srx1负调节依赖于Rad9的DNA损伤检查点。在DNA损伤修复完成后,检查点通过Rad53去磷酸化失活,磷酸酶Ptc2和Pph3通过不同的途径调节Rad53去磷酸化,本研究进一步探讨了Srx1是否有调节Rad53去磷酸化的功能,通过Western Blot实验发现srx1Δptc2Δ的Rad53磷酸化程度和srx1Δ一致,srx1Δpph3Δ的Rad53磷酸化程度高于srx1Δ,表明Srx1和Ptc2在同一条途径,和Pph3并行发挥作用调节Rad53去磷酸化。综上所述,本研究结果表明酿酒酵母中的Srx1基因缺失对DNA双链断裂损伤剂博来霉素敏感,Srx1参与DNA双链断裂损伤修复过程;Srx1通过和Mre11、Sae2相互作用参与DNA双链断Medical countermeasures裂末端切除进而促进同源重组途径来修复损伤;Srx1突变体引发的DNA双链断裂损伤导致Srx1负调节依赖于Rad9的DNA损伤检查点;Srx1和磷酸酶Ptc2在同一条途径,与磷酸酶Pph3并行发挥作用调节Rad53去磷酸化,使DNA损伤检查点失活。