研究目的:邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯(Di-(2-ethylhexyl)phthalate,DEHP)是常用的一种邻苯二甲酸酯类物质,广泛应用于制造聚氯乙烯塑料和各种家用产品。现有研究显示孕期DEHP暴露会引起母体糖代谢紊乱,但其作用机制尚不明确。本课题主要研究孕期DEHP暴露对糖代谢紊乱的孕鼠肝脏的损伤作用,探讨铁死亡是否介导了孕期DEHP暴露诱导的肝脏损伤及其在糖代谢紊乱中的作用。研究方法:本课题分为体内和体外实验两个部分。体内实验1):为了探讨孕期DEHP暴露对孕鼠糖代谢及肝功能的影响,将ICR孕鼠随机分为3组,分别为对照组,500 mg/kg DEHP暴露组,1000 mg/Medical order entry systemskg DEHP暴露组。于妊娠第4天(Gestational Day 4,GD4)至GD17进行灌胃处理,GD18进行剖杀取材,收集肝脏、血清等生物样本。实验期间测定孕早中晚期的空腹血糖水平;评估孕期小鼠的糖耐量和胰岛素耐量情况;同时检测小鼠血清肝功能指标AST和ALT水平;观察肝脏组织病理结构;评估肝脏组织中铁含量以及氧化应激水平;RT-q PCR和Western-blotting方法测定孕鼠肝脏组织中Gpx4、Slc7a11、Fth1、Ftl、Ptgs2、Nrf2等铁代谢和铁死亡相关基因及蛋白表达水平;体内实验2):为了探讨铁死亡抑制剂Ferrostatin-1(Fer-1)能否缓解孕期DEHP暴露造成的孕鼠肝脏损伤及糖代谢异常,将ICR孕鼠随机分为对照组、DEHP暴露组(1000 mg/kg)、DEHP(1000mg/kg)+Fer-1(5 mg/kg)暴露组,对照组和DEHP处理组的孕鼠分别从GD4经灌胃给予玉米油和1000 mg/kg DEHP至GD17;DEHP+Fer-1组孕鼠从GD4起进行腹腔注射Fer-1后1个小时进行DEHP灌胃处理,GD18进行剖杀取材,收集相关生物样本。实验期间评估孕鼠的糖代谢水平,肝损伤缓解情况,相关实验内容同实验(1)一致。体外实验:为了验证铁死亡在DEHP代谢产物MEHP暴露致Hep G2细胞损伤和在糖代谢异常中的作用,Hep G2经过无血清培养6小时后MEHP(0.1%DMSO、100μM、200μM)染毒处理24小时,收集细胞样品。检测细胞活性,评估Hep G2细胞内葡萄糖的含量变化。为了证实研究假设,分别使用GPX4活性抑制剂(RSL3,1μM)和Fer-1(10μM)预处理1小时后联合MEHP(200μM)染毒处理24小时。透射电镜观察细胞线粒体超微观结构;免疫荧光实验和流式分析测定细胞内活性氧ROS水平;RT-q PCR和Western blotting实验检测铁死亡通路中Gpx4、Nrf2、Slc7a11基因及其蛋白表达情况。研究结果:DEHP暴露引起孕鼠糖代谢异常,空腹血糖升高,胰岛素抵抗明显。体内和体外实验发现,DEHP高暴露组孕鼠出现肝损伤,肝组织中存在细胞充血,炎症细胞浸润等病理改selleck激酶抑制剂变,Hep G2细胞增殖活性显著降低,葡萄糖摄取率显著下降CCRG 81045采购。为进一步探究铁死亡在DEHP致孕鼠肝损伤中的作用,对肝脏细胞的氧化应激水平进行评估,高剂量DEHP组孕鼠肝脏丙二醛(Malondialdehyde,MDA)水平显著增加,谷胱甘肽(Glutathione,GSH)水平显著降低,二价铁含量明显升高,铁死亡相关通路蛋白GPX4、SLC7A11、NRF2水平发生显著性改变,采用铁死亡抑制剂Fer-1进行干预,孕鼠肝损伤程度得到缓解,空腹血糖水平降低,同时逆转孕期DEHP暴露导致的肝脏组织GPX4、SLC7A11蛋白表达水平降低,表明铁死亡参与孕期DEHP暴露引起的肝脏损伤和糖代谢紊乱过程。透射电镜观察到MEHP染毒组Hep G2细胞线粒体嵴皱缩,膜密度增大,线粒体外膜损伤。采用RSL3进行干预,与RSL3单独暴露组相比,RSL3和MEHP联合暴露组中Hep G2细胞的GPX4蛋白水平显著性下降;与MEHP单独暴露组相比,Fer-1和MEHP联合暴露组中GPX4蛋白水平得到明显升高,表明GPX4参与MEHP诱导的肝脏细胞铁死亡。研究结论:孕期DEHP暴露可引起孕鼠糖代谢紊乱和肝脏损伤。GPX4介导的肝细胞铁死亡参与了DEHP暴露所致的肝脏损伤过程,并对肝脏细胞糖代谢具有一定调控作用。